Génome

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8003 (2023) Citer cet article

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Au cours des dernières décennies, les effets néfastes des contaminants environnementaux sur la santé humaine sont devenus une préoccupation publique sérieuse. Les pesticides organophosphorés (OP) sont largement utilisés en agriculture, et les impacts négatifs de l'OP et de ses métabolites sur la santé humaine ont été démontrés. Nous avons émis l'hypothèse que l'exposition aux OP pendant la grossesse pourrait imposer des effets néfastes sur le fœtus en affectant divers processus. Nous avons analysé les réponses épigénétiques spécifiques au sexe dans les échantillons de placenta obtenus de la cohorte PELAGIE mère-enfant. Nous avons analysé la longueur des télomères et le nombre de copies mitochondriales à l'aide d'ADN génomique. Nous avons analysé H3K4me3 en utilisant l'immunoprécipitation de la chromatine suivie d'une qPCR (ChIP‒qPCR) et d'un séquençage à haut débit (ChIP-seq). L'étude humaine a été confirmée par l'analyse des tissus du placenta de souris. Notre étude a révélé une plus grande sensibilité des placentas masculins à l'exposition à l'OP. Plus précisément, nous avons observé un raccourcissement de la longueur des télomères et une augmentation des niveaux de γH2AX, un marqueur de dommages à l'ADN. Nous avons détecté une occupation plus faible de l'histone H3K9me3 au niveau des télomères dans les placentas mâles exposés au diéthylphosphate (DE) que dans les placentas non exposés. Nous avons constaté une augmentation de l'occupation de H3K4me3 au niveau des promoteurs du récepteur alpha des hormones thyroïdiennes (THRA), de la 8-oxoguanine ADN glycosylase (OGG1) et du facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF2) dans les placentas féminins exposés au DE. L'occupation de H3K4me3 au PPARG a augmenté dans les placentas masculins et féminins exposés au diméthylphosphate (DM). Le séquençage à l'échelle du génome d'échantillons sélectionnés a révélé des différences spécifiques au sexe induites par l'exposition aux DE. Plus précisément, nous avons trouvé des altérations de H3K4me3 dans des gènes liés au système immunitaire dans des échantillons de placenta féminin. Dans les placentas masculins exposés au DE, une diminution de l'occupation de H3K4me3 au niveau des gènes liés au développement, au collagène et à l'angiogenèse a été observée. Enfin, nous avons observé un nombre élevé de sites de liaison NANOG et PRDM6 dans des régions où l'occupation des histones était altérée, ce qui suggère que les effets étaient peut-être médiés par ces facteurs. Nos données suggèrent que l'exposition in utero aux métabolites organophosphorés affecte le développement placentaire normal et pourrait potentiellement avoir un impact sur la fin de l'enfance.

De plus en plus de preuves indiquent que l'exposition à des facteurs environnementaux peut avoir de profondes conséquences sur la santé humaine. Les effets les plus néfastes se produisent lors de l'exposition embryonnaire en raison de la reprogrammation épigénétique globale, des taux de prolifération élevés et des événements d'organogenèse. Selon la théorie de l'origine développementale des maladies humaines (DOHAD), formulée par David Barker, les conditions environnementales rencontrées dans les premières phases du développement peuvent avoir des effets à long terme sur les phases ultérieures de la vie1. Ce phénomène est lié à la plasticité biologique du développement, qui permet une reprogrammation aisée des fonctions physiologiques en réponse à différents stimuli. Par conséquent, l'exposition in utero aux polluants environnementaux peut augmenter la prédisposition à différentes pathologies qui peuvent survenir à la fois dans les phases précoces et tardives de la vie.

Dans cette étude, nous avons analysé les effets des métabolites des pesticides organophosphorés (OP) sur le placenta humain dans le cadre de l'initiative Human Biomonitoring for Europe (HBM4EU) afin de révéler de nouveaux biomarqueurs d'exposition aux pesticides organophosphorés. Les produits généraux de la détoxification des OP sont les phosphates de dialkyle (DAP), tels que le phosphate de diéthyle (DE) et le phosphate de diméthyle (DM), et ces métabolites sont normalement détectés dans l'urine par spectrométrie de masse2. Des études ont montré que l'exposition aux OP peut endommager les fonctions mitochondriales en raison de l'induction d'un stress oxydatif3. Les OP peuvent induire des cancers liés aux hormones4 et affecter le développement du système nerveux5. Chez les enfants, il a été démontré que l'exposition in utero aux OP est associée à un large éventail de pathologies du développement, telles que des dysfonctionnements cognitifs et un QI inférieur chez les garçons6 et des déficits de l'indice de mémoire de travail7. Les conséquences d'une exposition précoce à des substances toxiques pourraient être étudiées en analysant certains biomarqueurs dans des échantillons biologiques humains non invasifs, tels que le sang de cordon ombilical et le placenta. Le placenta est un organe transitoire qui sert de plateforme d'échange entre la circulation fœtale et maternelle, et il est disponible en grande quantité. Le placenta se développe à partir du trophectoderme (TE) à ~ 5 jours après la fécondation, ce qui correspond au stade blastocyste dans l'embryon préimplantatoire. Après l'implantation, les cellules trophoblastiques commencent à envahir l'utérus avec un remodelage vasculaire des vaisseaux sanguins de la mère. Des défauts de différenciation des cellules trophoblastiques pourraient induire des complications liées à la grossesse telles que la prééclampsie et entraîner un faible poids à la naissance chez les nourrissons8.

Il a été démontré que les facteurs de transcription sont importants pour l'expression précoce des gènes spécifiques à TE, notamment GATA39, TEAD410, TCFAP2C11 et EOMES12. Des études ont montré que de nombreux facteurs placentaires pouvaient être affectés par le stress environnemental. Par exemple, l'expression du facteur de croissance endothélial vasculaire A (VEGFA) était plus élevée dans le placenta des femmes qui fumaient, suggérant son rôle dans l'augmentation du risque de développer une prééclampsie associée au tabagisme13. Il a été rapporté que l'exposition in utero au cadmium, au BPA et aux bisphénols polychlorés augmentait l'expression de KISS1 de trois fois, suggérant des effets sur les voies des hormones stéroïdes14. Des cellules de cytotrophoblastes humaines isolées de placentas frais et exposées au BPA pendant 24 h ont montré une inhibition de la prolifération et une apoptose accrue, et ces événements ont été accompagnés d'une augmentation significative de l'expression du gène du facteur de nécrose tumorale alpha (TNFA) et des niveaux de protéines15. Ainsi, les toxiques environnementaux pourraient induire des altérations dans des processus importants en modifiant l'expression des gènes liés au développement et aux fonctions placentaires.

Il est suggéré que les mécanismes épigénétiques sont extrêmement vulnérables au cours du développement en raison de la nature hautement dynamique des processus de remodelage de la chromatine au cours du développement. Les mécanismes épigénétiques sont essentiels non seulement pour l'expression correcte des gènes spécifiques au type de cellule, mais également pour la sauvegarde de l'identité cellulaire. Parmi les mécanismes épigénétiques, la méthylation de l'ADN est la plus étudiée. Goodrich et al. ont montré que l'exposition précoce au plomb, au bisphénol A et aux métabolites des phtalates entraînait une hypométhylation de LINE1 et une hyperméthylation du gène à empreinte IGF2 dans le groupe exposé16. L'exposition au BPA a réduit la méthylation CpG des promoteurs de gènes associés au stress métabolique et oxydatif17.

Nous émettons l'hypothèse que des altérations de la régulation épigénétique peuvent affecter les processus placentaires normaux. Ces modifications des marques épigénétiques pourraient affecter l'expression de gènes essentiels au développement et à la croissance du fœtus. Dans cette étude, nous avons exploré les effets de l'exposition aux métabolites OP (DE et DM) sur le placenta humain de la cohorte PELAGIE mère-enfant de Bretagne, France. Nous nous sommes concentrés principalement sur l'exposition aux DE car nous n'avons pas observé de nombreuses associations statistiquement significatives avec l'exposition au DM.

Nous montrons que l'exposition in utero à l'OP entraîne des altérations globales d'importantes histones régulatrices à la fois dans les placentas masculins et féminins. Plusieurs conséquences de ces altérations sont discutées. Nos données suggèrent que l'exposition in utero aux métabolites organophosphorés affecte le développement placentaire normal et pourrait potentiellement avoir un impact sur la fin de l'enfance.

Un aperçu graphique des expériences réalisées dans cette étude est fourni à la Fig. S1. La longueur des télomères et le nombre de copies mitochondriales sont souvent utilisés comme marqueurs d'exposition toxicologique. Les télomères sont des répétitions d'hexanucléotides situées aux deux extrémités de chaque chromosome entourées de complexes d'ARN et de protéines. La longueur des télomères est réduite à chaque division cellulaire ; ainsi, la longueur des télomères est un marqueur de la sénescence cellulaire18. Les télomères pouvant être endommagés par le stress oxydatif19, nous avons choisi ce marqueur pour évaluer l'effet toxique de l'OP.

L'ADNmt est un autre marqueur couramment utilisé dans les études toxicologiques, car le stress oxydatif induit par les substances toxiques pourrait endommager les mitochondries et réduire leur nombre. L'ADNmt est de l'ADN extracellulaire, contrairement au génome nucléaire qui ne contient que deux copies par cellule, alors que le génome mitochondrial est présent en plusieurs copies par cellule (de 100 à 10 000), selon le type cellulaire20.

Nous avons effectué une analyse à l'aide d'ADN génomique et normalisé les copies d'ADNmt et TL au gène RPLP0. L'analyse a montré que le nombre de copies d'ADNmt était 1,2 fois plus élevé chez les hommes non exposés que chez les femmes non exposées ; cependant, la différence n'était pas significative (valeur p = 0,15) (Fig. 1A). De plus, l'analyse a montré que le TL était plus long chez les mâles que chez les femelles (p < 0,05, Fig. 1A).

Variations du nombre de copies identifiées dans les placentas humains masculins et féminins. (A) Il y avait une tendance vers un nombre plus élevé de copies d'ADNmt et des télomères plus longs dans le placenta masculin non exposé que dans le placenta féminin non exposé. (B) L'exposition à DE n'affecte pas de manière significative les copies d'ADNmt ou de TL dans les placentas féminins. (C) Il y a une tendance à une diminution de TL dans les placentas masculins exposés au DE. (D) Analyse quantitative de gH2AX dans le groupe masculin ; en haut, image représentative de l'analyse WB d'échantillons placentaires ; en bas, analyse quantitative de gH2AX. Des quantités égales d'ADN ont été prélevées pour chaque réaction. Le nombre de copies a été normalisé au gène RPLP0. *p < 0,05, ***p < 0,001, test de Mann‒Whitney.

Nous avons également comparé les différences d'ADNmt et de TL entre les groupes DE et non exposés dans les deux sexes : en réponse à DE, nous n'avons pas observé de changements dans les copies d'ADNmt ou de TL chez les femelles (Fig. 1B). Les copies d'ADNmt n'ont pas été affectées, mais le TL chez les mâles a été abaissé de 16 % (p = 0, 07) (Fig. 1C).

Étant donné que les altérations de TL pourraient être un marqueur de toxicité, qui induit très souvent des dommages à l'ADN, nous avons évalué si l'exposition aux DE pouvait induire des dommages à l'ADN. La phosphorylation de la variante d'histone H2AX sur le résidu Ser-139, générant ɣH2AX, est une réponse cellulaire rapide aux cassures double brin et c'est une étape clé pour initier la réponse aux dommages à l'ADN21. À cette fin, nous avons extrait les histones des placentas masculins et effectué des analyses quantitatives des niveaux de γH2AX à l'aide de WB. L'analyse quantitative a montré qu'il y avait une augmentation significative (1, 5 fois) de γH2AX dans les placentas masculins exposés au DE par rapport aux placentas non exposés, suggérant un effet génotoxique du DE sur les placentas humains (Figs. 1D, S2).

Pour examiner d'autres paramètres physiologiques pouvant contribuer à une faible résistance aux facteurs négatifs, nous avons pris en compte l'âge maternel, l'indice de masse corporelle et le statut tabagique. Nous avons constaté que TL et ɣH2AX restaient statistiquement significatifs après contrôle de l'âge maternel, de l'indice de masse corporelle et du statut tabagique (tableau 1).

Ainsi, l'analyse de la longueur des télomères et de gH2AX suggère que DE impose des effets néfastes sur les placentas masculins humains.

H3K9me3 est une marque de régulation de silence importante, et elle est enrichie au niveau des télomères et des centromères et des régions contenant des répétitions. Un dérèglement de cette marque a déjà été observé suite à une exposition à l'herbicide atrazine22. Puisqu'il a été démontré qu'une altération de H3K9me3 au niveau des télomères contribue à l'instabilité des télomères23, nous avons décidé de déterminer si les modifications de la longueur des télomères pouvaient être associées aux modifications de H3K9me3. À cette fin, nous avons effectué ChIP‒qPCR et analysé l'occupation de H3K9me3 au niveau de quelques éléments dans les centromères (SATA), les péricentromères (SAT2) et les régions des télomères (Tel). Notre analyse quantitative a révélé une profonde différence dans les niveaux de H3K9me3 au niveau des centromères, des péricentromères et des télomères entre les hommes non exposés et les femmes non exposées (Fig. 2A). Nous n'avons observé aucun changement dans H3K9me3 dans les cibles analysées dans les placentas féminins (Fig. 2B). L'histone H3K9me3 n'a pas montré de changements significatifs dans les cibles SAT2, mais elle avait tendance à diminuer dans le centromère SATA (p = 0, 1) dans les placentas mâles exposés au DE (Fig. 2C). Contrairement aux femmes, nous avons détecté une diminution significative de l'occupation de H3K9me3 au niveau des télomères (FC = 2, 1, p <0, 001) dans les placentas masculins exposés au DE, suggérant un impact possible du DE sur d'importantes marques d'histones régulatrices (Fig. 2C).

Occupation de l'histone H3K9me3 dans les régions répétitives du génome. (A) L'analyse de H3K9me3 a montré une occupation plus élevée de H3K9me3 au niveau des satellites et des télomères dans les placentas masculins non exposés que dans les placentas féminins non exposés. (B) Il n'y a eu aucun changement significatif dans les niveaux de H3K9me3 dans les placentas féminins exposés au DE. (C) Chez les hommes exposés, il y avait une tendance à une diminution de SATA et à une diminution de H3K9me3 aux télomères, ***p < 0,001, test de Mann‒Whitney.

Pour révéler les effets de l'exposition sur la régulation d'importants gènes du développement, nous avons analysé les occupations de l'histone H3K4me3 sur plusieurs cibles, notamment un gène à empreinte (IGF2), des récepteurs thyroïdiens (THRA et THRB), la kisspeptine (KISS1) et un marqueur de dommages à l'ADN, à savoir, 8-oxoguanine ADN glycosylase (OGG1).

Notre analyse a révélé que les placentas exposés au DE avaient augmenté H3K4me3 au niveau des promoteurs IGF2, THRA et THRB de 1, 7, 1, 5 et 1, 6 fois, respectivement (Fig. 3A). Nous avons observé que le placenta féminin présentait une augmentation de 1, 6 fois de l'occupation du promoteur du facteur de réparation de l'ADN OGG1 (Fig. 3A). Les placentas mâles n'ont pas montré de différences significatives dans H3K4me3 au niveau des cibles étudiées (Fig. 3B).

Occupation de l'histone H3K4me3 au niveau des gènes de développement dans les placentas DE. Les effets de DE sur les placentas féminins (A) ou masculins (B), *p < 0,05, **p < 0,01, test de Mann‒Whitney.

De même, nous avons réanalysé nos données en comparant nos données avec d'autres paramètres physiologiques, tels que l'âge maternel, l'indice de masse corporelle et le statut tabagique. Nous avons constaté que les altérations de l'IGF2, de l'OGG1 et de la THRA restaient statistiquement significatives dans les placentas féminins. De plus, nous avons observé un changement significatif de l'IGF2 dans le placenta masculin après contrôle de l'âge maternel, de l'indice de masse corporelle et du statut tabagique (tableau 2).

Nous avons également analysé H3K4me3 dans le contexte de l'exposition au DM. Notre analyse a révélé que les placentas exposés au DM avaient augmenté H3K4me3 au niveau du promoteur PPARG de 1, 8 et 2, 8 fois dans les placentas féminins (Fig. S3A) et les placentas masculins, respectivement (Fig. S3B). L'occupation de H3K4me3 à OGG1 a montré une tendance à augmenter (p = 0,06 pour les deux) de 1,4 et 1,6 fois dans les placentas féminins et masculins, respectivement.

Ainsi, notre analyse de l'occupation du promoteur H3K4me a montré que l'exposition au DE et au DM provoque des altérations des gènes codant pour l'empreinte, le récepteur de l'hormone thyroïdienne et les facteurs de réparation de l'ADN.

Pour révéler les effets de l'exposition in utero au DE sur les marques régulatrices de la transcription au niveau du génome et pour trouver de nouvelles cibles, nous avons analysé la distribution à l'échelle du génome des marques H3K4me3 en utilisant la chromatine du placenta de 4 placentas non exposés et de 10 placentas exposés au DE de femelles. et 5 placentas non exposés et 12 DE-exposés de mâles (les détails sont fournis dans la section "Méthodes"). Un aperçu des résultats de séquençage est présenté dans un graphique Circos de toutes les données de séquençage (Fig. 4A). Nous avons observé une diminution globale de H3K4me3 dans les échantillons masculins exposés par rapport aux échantillons non exposés et une augmentation globale des niveaux de H3K4me3 dans les placentas féminins exposés.

L'occupation H3K4me3 est globalement affectée dans le placenta humain. (A) Le graphique Circos montre les régions de H3K4me3 significativement modifiées chez l'homme. Le graphique indique les valeurs de changement de pli log2 normalisées pour les régions différentielles significatives. La carte thermique Circos la plus interne concerne les différences entre les échantillons féminins. L'anneau le plus externe indique l'emplacement du chromosome. Traces circulaires de l'extérieur vers l'intérieur : carte thermique des régions différentielles lors de la comparaison d'échantillons masculins et féminins. La carte thermique suivante montre les différences entre les hommes exposés au DE par rapport aux témoins, et le dernier graphique montre les régions différentielles dans les échantillons exposés au DE et les échantillons témoins. Certains gènes situés dans les régions différentielles sont indiqués. (B) H3K4me3 à XIST (en haut) a été détecté uniquement dans les placentas féminins, et H3K4me3 à ZFY (en bas) a été détecté uniquement dans les placentas masculins.

Pour révéler les différences spécifiques au sexe dans l'occupation de H3K4me3, nous avons comparé les données de séquençage entre tous les échantillons de femmes et d'hommes (Fig. 4A). L'analyse en composantes principales (PCA) a montré la différence substantielle entre les échantillons de placenta masculin et féminin (Fig. S4A – C).

Nous avons également confirmé que le niveau de protéine H3K4me3 dans le placenta mâle était plus élevé par WB quantitatif d'histones purifiées provenant de placenta mâle non exposé et femelle non exposé, comme nous l'avons fait pour γH2AX (Fig. S5A). Notre analyse a montré que H3K4me3 est plus faible chez la femme que chez le placenta masculin (Fig. S5B).

Notre analyse a révélé que 817 pics (FC> 2), situés à proximité de 1201 gènes, étaient exprimés de manière différentielle entre les hommes et les femmes (Fig. 4A, deuxième carte thermique du diagramme Circos). L'ensemble de données soutenant les conclusions de cet article est inclus dans l'article (Supplementary Dataset File_1). Nous avons détecté plusieurs régions uniques aux placentas féminins ou masculins (tableau S1). Par exemple, nous avons détecté que les placentas féminins avaient des marques dans le gène XIST et que seuls les placentas masculins avaient des marques H3K4me3 au niveau du promoteur du gène ZFY (tableau S1, figure 4B). L'analyse montre qu'au niveau mondial, les femmes ont une occupation H3K4me3 plus faible, par exemple au niveau du gène NANOS3 (Fig. S6A).

Ensuite, nous avons demandé si les différences entre les régions H3K4me3 féminines non exposées et masculines non exposées étaient situées à proximité de gènes partageant des fonctions biologiques communes. Nous avons attribué des gènes dans des pics différentiels à l'aide de GREAT et effectué une annotation fonctionnelle à l'aide du programme DAVID. Nous nous sommes concentrés sur l'analyse des processus biologiques. L'annotation fonctionnelle a révélé que les régions différentielles comprenaient des régions de gènes canoniques de la voie de signalisation WNT, d'engagement du destin cellulaire et de gènes de vasculogenèse, entre autres (Fig. S6B).

Ensuite, nous nous sommes demandé si l'exposition aux DE entraînait des modifications des occupations H3K4me3. Les H3K4me3 différentiels ont été localisés dans les promoteurs comme prévu (Fig. S7A, B). L'analyse comparative de H3K4me3 entre les placentas féminins non exposés et exposés a montré que l'occupation de H3K4me3 était modifiée dans 466 régions situées à proximité de 620 gènes (FC ≥ 2, FDR ≤ 0,16). L'ensemble de données soutenant les conclusions de cet article est inclus dans l'article (Supplementary Dataset File_2). Par exemple, l'augmentation de l'occupation a été déterminée dans le gène VAV1 (Fig. 5A), qui code pour une protéine qui joue un rôle essentiel dans le développement et l'activation des lymphocytes T et B. L'annotation fonctionnelle de tous les gènes a montré que les voies biologiques de la régulation leucocytaire de la forme cellulaire et de la réponse immunitaire (Fig. 5B) étaient affectées.

Analyse fonctionnelle de gènes localisés dans des régions altérées. (A) Dans le promoteur du gène VAV1, il y a une occupation plus élevée dans H3K4me3 dans les placentas féminins exposés à DE. (B) L'annotation fonctionnelle des gènes situés dans les pics différentiels détectés dans les placentas féminins exposés au DE montre un enrichissement en termes de processus biologiques. (C) L'occupation de l'histone H3K4me3 a diminué au niveau des promoteurs des gènes MEIS3 et (D) COL5A1. (E) Annotation fonctionnelle des gènes situés dans les régions H3K4me3 altérées dans les placentas mâles exposés.

Chez les mâles exposés, nous avons déterminé que 484 régions étaient affectées, qui étaient situées à proximité de 597 gènes avec FC > 2 et FDR < 0,05 (Fig. 4A). L'ensemble de données soutenant les conclusions de cet article est inclus dans l'article (Supplementary Dataset File_3). Par exemple, des régions différentielles ont été localisées dans le gène homéobox HOX MEIS1 (Fig. 5C), qui joue un rôle crucial dans le développement normal, et COL5A1 (Fig. 5D), un gène important pour le développement du système circulatoire et l'organisation du collagène. L'annotation fonctionnelle a montré un enrichissement dans le développement du système squelettique, l'angiogenèse et les processus cataboliques du collagène, entre autres (Fig. 5E).

Pour déterminer si des motifs d'ADN régulateurs sont présents dans les régions contenant des pics altérés, nous avons utilisé MEME-CHIP24. Nous avons demandé s'il y avait un enrichissement pour les sites de liaison des facteurs de transcription chez les femmes et les hommes DE. Nous avons extrait des séquences situées dans des pics différentiels et effectué un masquage répété pour supprimer les séquences répétitives de l'analyse. Les fichiers résultants au format fasta ont été traités dans MEME-CHIP. L'analyse a révélé des motifs significativement enrichis parmi les pics différentiels dans les placentas féminins et masculins exposés au DE. Par exemple, nous avons détecté des motifs riches en AT dans les placentas féminins (valeur e = 8,3e-005) (Fig. 6A, en bas). Une partie du motif est similaire au site de liaison NANOG (valeur p 3,35e-04, valeur q = 1,18e-01) (Fig. 6A, en haut). L'autre motif identifié était similaire à AR, la liste complète des motifs MEME sur la figure S8.

Analyse des motifs dans les régions situées dans les pics différentiels des placentas féminins ou masculins. (A) Un motif riche en AT (en bas) a été détecté dans les pics différentiels H3K4me3 des placentas féminins exposés au DE, et une partie du motif est similaire à NANOG (en haut). (B) Un motif riche en T a été identifié dans les pics différentiels H3K4me3 du placenta mâle exposé au DE (en bas), et une partie du motif est similaire au site de liaison PRDM6 (en haut). Les carrés en pointillés montrent la partie correspondante du motif au site de liaison du facteur de transcription. (C) Le site de liaison PRDM6 identifié a été détecté dans le gène COL5A1 dans les placentas mâles exposés au DE, et le motif PRDM6 est représenté en vert. La séquence est conservée entre les génomes de souris et humains.

Dans les placentas masculins, un motif riche en T a été détecté (valeur e = 1,0e-010) et une partie de la séquence de motifs enrichie découverte était similaire au site de liaison PRDM6 (Fig. 6B) (valeur p 6,98e-07, valeur q = 5,40e−04). Par exemple, le motif riche en T a été trouvé dans le gène COL5A5 (Fig. 6C). D'autres motifs identifiés étaient similaires aux facteurs SP1/2 et VEZF1, la liste complète des motifs MEME se trouve sur la Fig. S9.

Pour confirmer les différences spécifiques au sexe dans le placenta, nous avons analysé des cibles humaines identifiées dans les placentas de souris. Les souris ont été disséquées au jour embryonnaire 15,5, lorsque le placenta était bien formé. Le sexe de l'échantillon de placenta a été déterminé par analyse des gonades d'embryons correspondants. Nous avons fixé le placenta avec du paraformaldéhyde, enrobé le tissu dans de la paraffine et analysé la morphologie tissulaire des coupes colorées au H&E (Fig. S10). Les placentas masculins et féminins avaient des morphologies similaires.

Puisque nous avons identifié un niveau plus élevé de H3K4me3 dans les placentas humains chez les mâles que chez les femelles, nous avons demandé si les souris avaient un schéma similaire. À cette fin, nous avons effectué une coloration immunofluorescente des sections en utilisant un anticorps contre H3K4me3 (Fig. 7A). Nous avons effectué une analyse quantitative de H3K4me3 dans un grand nombre de cellules. L'analyse a montré que H3K4me3 était significativement plus élevé chez les mâles (Fig. 7B), suggérant la cohérence de l'occupation des histones chez les souris et les humains.

Analyse spécifique au sexe dans le placenta murin. (A) L'intensité de H3K4me3 dans le placenta masculin est supérieure à celle du placenta féminin. Le sexe du placenta féminin ou masculin a été identifié par dissection des embryons au jour embryonnaire (E15). Le placenta a été fixé dans une solution de paraformaldéhyde et des coupes ont été réalisées. Les coupes ont été immunocolorées avec l'anticorps H3K4me3. Les images ont été prises avec le même temps d'exposition et le niveau de fluorescence de 150 cellules a été analysé pour chaque réplique biologique à l'aide de Fidji. (B) La fluorescence H3K4me3 a été normalisée au signal DAPI, et les valeurs moyennes ont été tracées et présentées sous forme de fluorescence normalisée. 20 × objectif, n = 4 pour chaque groupe. (C) L'expression du gène du placenta montre un dimorphisme sexuel. L'ARN a été extrait des placentas mâles et femelles E15, et l'ADNc a été généré et utilisé pour la RT‒qPCR. L'expression génique a été normalisée par rapport au gène domestique Rpl37a, n = 8 pour chaque groupe, * P < 0, 05, ** P < 0, 01 *** P < 0, 001, test de Mann-Whitney.

Ensuite, pour révéler si les changements spécifiques au sexe dans l'occupation des histones sont accompagnés d'une expression génique, nous avons effectué une analyse RT‒qPCR des cibles qui ont montré des différences spécifiques au sexe. Nous avons choisi des gènes importants codant pour des facteurs protéiques jouant un rôle essentiel dans la formation des trophoblastes (Gata6, Ppara, Pparg, Tbx2, Cdh2, Irx3, Nanos3 et Eif5) et des gènes exprimés dans tous les types cellulaires, y compris des facteurs importants pour le cytosquelette (Actg1), l'apoptose (Bnip3), la réparation de l'ADN (Alkbh3 et Ogg1), la vasculogenèse (Vegfa et Cdh2) et l'épigénétique (Ezh2). L'analyse a montré des différences spécifiques au sexe dans les gènes importants pour la fonction des trophoblastes. L'expression génique de Gata6, Nanos3, Ezh2, Ppara, Pparg et Eif5 (Fig. 7C) était plus élevée chez les hommes, similaire à l'occupation de la marque H3K4me3 chez l'homme. Nous avons identifié que l'ARNm de Xist n'était exprimé que chez les femmes, similaire à la présence de marques H3K4me3 au niveau du promoteur de XIST dans le placenta humain féminin.

Ainsi, l'analyse de l'expression génique dans le placenta de souris a montré des altérations spécifiques au sexe dans l'occupation de l'histone H3K4me3.

Nous avons observé que l'exposition à DE conduit à des altérations de la longueur des télomères. Plusieurs études ont montré que les facteurs de stress entraînent des altérations du TL. Par exemple, l'utilisation de pesticides pour les cultures de tabac conduit à un TL raccourci Kahl et al.25. L'utilisation d'un autre pesticide, le malathion, a également conduit à une TL plus courte (p = 0,03) Andreotti et al.26. Le stress oxydatif pourrait également contribuer aux dommages et au raccourcissement des télomères19. Puisque nous avons observé une augmentation de γH2AX et une augmentation de l'occupation des histones au niveau de la 8-oxoguanine glycosylase (OGG1), nous pouvons imaginer un rôle potentiel de DE dans le raccourcissement des télomères via l'oxydation de la guanine et des dommages globaux à l'ADN.

D'autre part, il est suggéré que des altérations de l'activité enzymatique qui allonge les répétitions des télomères (télomérase [TERT]) pourraient être pertinentes pour l'allongement ou le raccourcissement des télomères. L'activité de TERT a été observée dans les placentas IUGR, où le raccourcissement des télomères a été expliqué par une diminution de l'expression de l'ARNm de hTERT27. Une diminution de TL pourrait également s'expliquer par une stabilité altérée au niveau des télomères, qui est normalement maintenue par les marques de l'histone H3K9me3. Nous avons observé une diminution de H3K9me3 dans les régions des télomères en réponse à DE chez les mâles. Il a été suggéré que des niveaux élevés de H3K9me3 au niveau des télomères sont nécessaires pour contrôler l'expression du transcrit des télomères TERRA ; dans le cas contraire, l'expression accrue de TERRA entraîne un raccourcissement des télomères28. Cette suggestion a été étayée par la preuve que la densité accrue de H3K9me3 a été détectée à des télomères plus longs28. Le mécanisme exact de cette régulation n'est pas bien compris.

La diminution de H3K9me3 au niveau des télomères pourrait être due à des activités compromises d'enzymes introduisant H3K9me3, telles que SUV39H1/H2. Par exemple, l'exposition au furane, un contaminant chimique qui se forme dans certains aliments lors des techniques traditionnelles de traitement thermique, provoque une régulation négative significative de SUV39H1 et SUV39H229. De même, nous suggérons que des altérations des activités de ces enzymes pourraient être responsables du niveau inférieur de H3K9me3. Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour confirmer cette connexion.

Nous avons détecté des niveaux plus élevés de H3K9me3 au niveau des répétitions des télomères chez les hommes par rapport aux placentas féminins. Ce phénomène pourrait être dû au fait que dans les placentas masculins, les télomères sont plus longs, donc plus de H3K9me3 pourrait être associé aux télomères.

Ainsi, notre observation suggère que l'exposition à DE affecte H3K9me3 au niveau des télomères, ce qui pourrait être responsable du raccourcissement des télomères.

Nous avons identifié une augmentation de H3K4me3 à IGF2 dans le placenta féminin. IGF2 est un gène paternellement imprimé et sa fonction est de réguler le transfert de nutriments de la mère au fœtus dans les cellules trophoblastiques30. La protéine codée par IGF2 joue un rôle dans les voies hormono-dépendantes du placenta31. Des niveaux élevés d'IGF2 ont été détectés dans des placentas humains exposés à l'éthanol32, suggérant que dans des conditions toxiques, la préservation de l'expression monoallélique est perturbée ou la voie nutritionnelle de la mère à l'enfant est endommagée.

Nous avons observé une augmentation de l'occupation THRA H3K4me3 chez les femmes. L'hormone thyroïdienne (TH) est indispensable au développement normal de l'embryon et du fœtus. Tout au long de la gestation, la TH est apportée par la mère via le placenta ; plus tard au cours de la grossesse, la glande thyroïde fœtale apporte une contribution croissante. Une augmentation de l'expression de l'ARNm de THRA a été observée dans les placentas de moutons restreints en nutriments, et il a été suggéré que cette augmentation de l'expression génique est un effort pour compenser les concentrations plus faibles de T4 et de T3 dans le sang maternel chez les moutons restreints en nutriments33 .

Nous avons identifié des altérations dans de nombreux gènes du développement, y compris des gènes impliqués dans les processus cataboliques du collagène, chez les mâles exposés au DE. L'expression élevée de collagène à l'interface materno-fœtale peut induire un microenvironnement de tolérance immunitaire en régulant la différenciation et la fonction des cellules immunitaires dans la caduque, ce qui est important pour une implantation et une grossesse réussies. Une étude a identifié COL4A1 et COL4A2 comme gènes de susceptibilité maternelle à la prééclampsie34. Ainsi, les altérations de l'histone H3K4me3 au niveau des gènes liés au collagène pourraient refléter des perturbations dans les processus du microenvironnement placentaire susceptibles d'augmenter le risque de complications de la grossesse. Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour déterminer le rôle de DE dans la morphologie cellulaire et la forme des types de cellules placentaires.

Nous avons observé un grand nombre de sites de liaison pour NANOG dans les pics H3K4me3 altérés, qui sont fortement exprimés dans les cellules souches pluripotentes. Il a été postulé que NANOG est impliqué dans la pathogenèse de la maladie trophoblastique gestationnelle, probablement par son effet sur l'apoptose et la migration cellulaire35. L'activation de NANOG pourrait être impliquée dans les problèmes de croissance placentaire, et sa régulation pourrait être perturbée et contribuer aux pathologies placentaires.

D'autre part, nous avons constaté qu'un grand nombre de pics ont des sites de liaison pour PRDM6. Ce gène code pour un gène répresseur transcriptionnel exprimé par des précurseurs vasculaires36. Il a été démontré que PRDM6 démontre une activité de répresseur transcriptionnel en interagissant avec les histones désacétylases de classe I et l'histone méthyltransférase G9a37. PRDM6 s'est avéré significativement associé à la pression artérielle systolique chez les personnes d'origine européenne38, et les mutations de PRDM6 provoquent des malformations cardiaques congénitales courantes39. Ainsi, PRDM6 peut jouer un rôle important dans le silençage épigénétique qui est crucial pour la vasculogenèse et le développement cardiaque ; par conséquent, PRDM6 est un candidat solide en tant que protéine responsable de la diminution globale observée de l'activation de l'histone H3K4me3 dans le placenta masculin dans notre étude.

Le fœtus et le placenta expriment des antigènes paternels. Bien que reconnus par le système immunitaire maternel, les changements dans les réponses immunitaires systémiques et locales (utérines) abrogent les réactions adaptatives cytotoxiques normales tout en améliorant les réponses régulatrices et tolérogènes permettant à la grossesse de progresser. Les cytokines, les facteurs de croissance et les voies de signalisation hormonales jouent un rôle important lors de l'implantation et de la parturition. La grossesse confère une susceptibilité unique à l'infection; les agents infectieux sont de plus en plus impliqués dans le déclenchement des complications de la grossesse et les perturbations induites par l'infection dans la tolérance fœtale. Nous suggérons que les altérations observées dans les gènes du système immunitaire pourraient conduire à une plus grande susceptibilité aux infections des placentas mâles.

Nos données confirment l'observation précédente selon laquelle les embryons mâles présentent une plus grande vulnérabilité in utero aux facteurs environnementaux, mais le mécanisme à l'origine de cette différence de sexe n'est toujours pas clair40. Il existe une opinion soutenue par les travaux de Cvitic et al.41 suggérant qu'il y a moins de compatibilité immunitaire dans les interactions mère-fœtus pour les hommes, ce qui peut déclencher une réponse immunitaire plus élevée chez les fœtus mâles, entraînant ainsi un état pro-inflammatoire.

Les échantillons biologiques humains ne nous ont pas permis d'analyser l'expression de l'ARNm et les protéines codant pour les facteurs de transcription. Même si nos résultats sont restés similaires après avoir contrôlé certaines caractéristiques maternelles (âge, indice de masse corporelle et statut tabagique), la forte variation des données pourrait s'expliquer par la contribution d'autres facteurs non mesurés auxquels les humains sont exposés au début de la vie. Cette étude a révélé de nouveaux biomarqueurs et cibles qui devraient être confirmés et étudiés davantage à l'aide de modèles animaux ou de culture cellulaire afin de mieux comprendre les effets négatifs des métabolites organophosphorés sur le placenta humain. Une autre limite de la présente étude est liée à l'évaluation de l'exposition aux OP à l'aide d'un seul échantillon d'urine. Les OP ont une courte demi-vie biologique et sont rapidement éliminés en quelques heures à quelques jours. Par conséquent, il existe des variations intra-individuelles quotidiennes et intra-journalières des concentrations urinaires d'OP. Nous avons donc choisi de dichotomiser les variables d'exposition en supposant que les groupes sont moins sujets aux erreurs de classification de l'exposition et reflètent mieux les niveaux d'exposition de fond.

Nos données suggèrent que l'exposition aux métabolites OP induit des différences spécifiques au sexe en réponse à l'exposition, ce qui pourrait avoir un impact sur la croissance et le développement du fœtus. Les nouveaux facteurs identifiés pourraient être étudiés plus avant en tant que biomarqueurs de l'exposition aux OP.

Toutes les méthodes ont été réalisées conformément aux directives et réglementations en vigueur. Dans cette étude, nous avons cherché à analyser les effets des métabolites des pesticides organophosphorés (OP) sur le placenta humain afin de révéler de nouveaux biomarqueurs d'exposition aux pesticides organophosphorés. Quatre-vingt-quatorze échantillons de placenta humain, 46 mâles et 48 femelles, ont été obtenus à partir de la cohorte mère-enfant PELAGIE (voir la section "Méthodes"), et les concentrations de DE et de DM ont été mesurées dans des échantillons d'urine maternelle avant 19 semaines de gestation (Figs . S11 et S12, respectivement). L'ADN mitochondrial (mt) et les copies de la longueur des télomères (TL) ont été analysés dans l'ADN génomique d'échantillons de placenta à l'aide de la méthode ChIP‒qPCR. Nous avons étudié l'occupation de H3K9me3 dans l'ADN du satellite centromère alfa (SATA) et du satellite péricentromérique 2 (SAT2) et dans les régions des télomères. Nous avons analysé les occupations de l'histone H3K4me3 sur des cibles sélectionnées dans tous les échantillons. Comme cibles, nous avons choisi des gènes importants pour le développement placentaire (PPARA, PPARG et KISS1) et le fonctionnement (IGF2, PGR, THRA et THRB), et nous avons étudié un marqueur du stress oxydatif (OGG1). Pour révéler de nouvelles cibles d'OP qui pourraient servir de biomarqueurs d'exposition, nous avons effectué une analyse à l'échelle du génome dans un petit groupe d'échantillons sélectionnés. Dans les placentas de souris, la morphologie, les niveaux globaux d'histone H3K4me3 et l'expression des gènes ont été analysés au jour embryonnaire 15 (E15).

La cohorte PELAGIE (Perturbateurs Endocriniens : Étude Longitudinale sur les Anomalies de la Grossesse, l'Infertilité et l'Enfance) est une cohorte mère-enfant recrutée en population générale en Bretagne (France) de 2002 à 2006. Les femmes enceintes ont été incluses lors de leur première visite de grossesse par des gynécologues, des obstétriciens ou des échographistes. Un des critères d'inclusion était d'être enceinte depuis moins de 19 semaines de gestation. Dans la population étudiée, l'âge gestationnel à l'inclusion (= au prélèvement d'urine) variait de 6 à 15 semaines de gestation avec une médiane à 11.

Des échantillons d'urine du premier matin ont été prélevés sur chaque femme enceinte une seule fois à leur inclusion avant 19 semaines de gestation, dans laquelle les six métabolites non spécifiques de dialkylphosphate (DAP) de nombreux insecticides OP [diéthylphosphate (DEP), diéthylthiophosphate (DETP), diéthyldithiophosphate (DEDTP), diméthylphosphate (DMP), diméthylthiophosphate (DMTP) et diméthyldithiophosphate (DMDTP)] ont été mesurés. Les analyses chimiques ont été réalisées par l'Institut LABOCEA (Plouzané, France) avec extraction en phase solide (SPE) et chromatographie liquide‒électrospray ionisation spectrométrie de masse en tandem (LC/MS–MS). Les détails, y compris les procédures de contrôle/assurance qualité et l'équipement, sont fournis dans les travaux précédents42. A l'inclusion, les femmes enceintes ont été invitées à remplir un questionnaire comprenant les caractéristiques démographiques, professionnelles et médicales, ainsi que les habitudes alimentaires et le mode de vie. Les caractéristiques de la population étudiée sont présentées dans le tableau ci-dessous (Tableau 3).

La population étudiée comprenait des participantes en bonne santé avec la plupart des mères ayant un indice de masse corporelle dans la fourchette normale (77 %), avec un niveau d'éducation élevé (68 % avec un diplôme universitaire) et peu de fumeuses au début de la grossesse (15 % ). L'ethnicité est une donnée non collectable en France mais on sait qu'une seule mère a ses deux parents d'origine non européenne. De même, les nouveau-nés sont en bonne santé sans naissance prématurée et avec un poids moyen à la naissance de 3426 g (6 enfants sont nés petits pour leur âge gestationnel). Dans l'ensemble, il n'y a pas d'association entre ces caractéristiques et les niveaux de DM ou de DE, à l'exception d'une corrélation négative entre l'exposition au DM et le poids à la naissance (corrélation de Spearman = − 0,21, p = 0,049) et des niveaux de DE plus élevés chez les femmes titulaires d'un diplôme universitaire (DE médian = 0,65 nmol/L) que l'autre (DE médiane ≤ LOQ).

À la naissance, les données des dossiers de maternité et d'autres échantillons biologiques ont été recueillies. Les prélèvements comprenaient un rectangle de 10 cm3 de placenta, le plus près possible du point d'implantation du cordon, qui était ensuite congelé à – 80 °C. À 6 ans, un examen neuropsychologique des enfants a été organisé pour étudier le rôle de l'exposition prénatale à des neurotoxiques potentiels, dont les OP, sur les performances cognitives des enfants42,41,44. Cet examen a exclu les jumeaux et les enfants présentant des problèmes de santé majeurs pour lesquels un impact sur le développement neuropsychologique est bien établi (ex. : état de prématurité sévère, anomalies génétiques spécifiques). Un sous-groupe de 94 participants de cet examen a été sélectionné pour la présente étude, incluant ceux ayant la plus forte participation aux suivis de la cohorte PELAGIE entre la naissance et 6 ans et disposant d'échantillons placentaires disponibles (environ 60% de la cohorte) : 48 filles et 46 garçons. Pour cette étude, chacun de ces échantillons de placenta a été coupé à quatre à six endroits différents, et ces morceaux ont été hachés finement pour obtenir une composition cellulaire homogène pour chaque échantillon. Les échantillons de placenta hachés ont été conservés à - 80 ° C jusqu'à leur utilisation. Les concentrations de métabolites urinaires ont été converties de microgrammes par litre en leurs concentrations molaires (nanomoles par litre). Les concentrations globales de DE ont été obtenues avec la somme des concentrations de DEP, DETP et DEDTP (Fig. S11, Tableau 4). Les concentrations de DM ont été obtenues comme la somme des concentrations de DMP, DMTP et DMDTP (Fig. S12, Tableau 4). Les limites de quantification (LOQ) pour les analyses chimiques des échantillons d'urine maternelle étaient de 1,25, 1,7, 0,02, 0,2, 1 et 0,45 μg/L pour le DEP, le DETP, le DEDTP, le DMP, le DMTP et le DMDTP, respectivement. Les coefficients de variation à LOQ sont respectivement de 19, 19, 20, 17, 19 et 20 %.

L'extraction de l'ADN a été réalisée à l'aide des kits DNeasy Blood & Tissue (Qiagen) en suivant les instructions du fabricant. L'extraction d'ADN comprenait une étape de traitement à la RNAse A pour éviter la présence d'ARN. La concentration d'ADN a été mesurée à l'aide du système QuantiFluor dsDNA (Promega). La qualité de l'ADN a été évaluée en exécutant des échantillons sur un gel d'agarose à 0,7 %, où une seule bande pour chaque échantillon a été observée. La qualité de l'ADN a également été confirmée par le rapport de A260 à A280, qui était supérieur à 1,8.

L'ADN génomique extrait a été dilué pour obtenir une concentration de 0,1 ng/μL, et des quantités égales d'ADN génomique extrait ont été utilisées pour la qPCR. La PCR quantitative a été réalisée à l'aide d'une plaque 384 puits. Chaque puits contenait 5 μL de SYBR® Green Master Mix (Bio-Rad), 0,05 μL de chaque paire d'amorces (solution mère 100 μM), 0,9 μL de H2O et 4 μL de matrice d'ADN. La qPCR a été réalisée à l'aide d'un système en temps réel CFX 384 (Bio-Rad) avec un protocole en deux étapes : dénaturation initiale à 98 °C pendant 30 s, suivie d'un programme de 40 cycles d'amplification à 98 °C pendant 15 s et 65 pendant 1 min. Le programme de fusion a été réalisé après le programme PCR. Les valeurs d'expression normalisées ont été calculées avec le programme interne CFX Manager, fourni par la machine 384 CFX Bio-Rad en utilisant RLP0 comme gène de référence. Les amorces utilisées dans cette étude sont répertoriées dans le tableau S2.

L'extraction des histones a été réalisée à l'aide d'un kit d'extraction d'histones ab113476 (Abcam) conformément aux instructions du fabricant. En bref, des quantités égales de placenta (~ 100 mg) ont été prélevées sur chaque échantillon et homogénéisées à l'aide de billes métalliques et de TissueLyser II (Qiagen), suivies d'une centrifugation et d'une lyse du culot pour isoler des protéines très basiques dans le surnageant, telles que les histones. Les concentrations de protéines ont été estimées à l'aide d'un test de protéines Pierce 660 nm (Thermo Scientific).

Des Western blots ont été préparés en utilisant l'anticorps polyclonal de lapin anti-histone γH2AX (Trevigen, 4411-PC-100, dilution 1:1000). Des quantités égales de protéines histones (10 μg) dans du tampon Tris 10 mM et du tampon Laemmli 4X ont été dénaturées et passées sur un gel SDS‒PAGE à gradient de 4 à 15% (Mini-PROTEAN® TGXTM Precast Protein Gels). Les protéines ont été transférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF) (Millipore, France) à l'aide d'un système d'électroblotter (TE77X; Hoefer, USA) pendant 1,15 h. Le blocage a été effectué en utilisant du lait à 5 % dans 1X TBS Tween 0,05 %. L'anticorps primaire a été dilué dans 10 mL de la solution de blocage et les membranes ont été incubées pendant une nuit à 4 °C. Après trois lavages de 10 minutes avec du TBS 1X, chaque membrane a été incubée pendant 1 h dans 40 ml de solution de blocage contenant les anticorps secondaires conjugués à la HRP correspondants (GE Healthcare, USA). Après trois autres lavages de 10 minutes avec 1 × TBS, des réactifs de détection de transfert Western (Amersham ECLTM Prime Western blotting Detection Reagents) ont été utilisés pour recouvrir chaque membrane pour le développement des complexes d'anticorps primaires et secondaires. L'expression spécifique de la protéine pour l'anticorps a ensuite été photographiée à l'aide d'un imageur moléculaire (ChemiDocTM XRS + System with Image LabTM Software). Des bandes d'histones H3 colorées au rouge Ponceau ont été utilisées pour normaliser les niveaux de γH2AX pour chaque échantillon (Fig. S2). L'intensité des bandes a été mesurée dans le logiciel Fiji : ImageJ.

Nous avons réalisé ChIP en utilisant des anticorps polyclonaux de lapin contre H3K4me3 (Millipore, 07-473) ou H3K9me3 (Abcam, ab8898). Une quantité égale de matériel (~ 50 mg) a été pesée à partir de chaque échantillon de placenta et incubée dans une solution de paraformaldéhyde à 1 % pendant 10 min pour réticuler les protéines à l'ADN. Ensuite, 100 μL de glycine 1,25 M ont été ajoutés à chaque échantillon pour désactiver le paraformaldéhyde non lié. Les échantillons ont été centrifugés et 1 ml de PBS et deux billes métalliques ont été ajoutés au culot, qui a ensuite été homogénéisé à l'aide d'un TissueLyser (Qiagen). Ensuite, les échantillons ont été filtrés dans une passoire cellulaire, et la solution résultante a été sédimentée et remise en suspension dans le tampon suivant : 0,25 % (vol/vol) Triton X-100, 10 mM EDTA, 0,5 mM EGTA et 10 mM Tris, pH 8. Les échantillons ont été centrifugés à 1100 tr/min pendant 5 min à 4 °C, et le culot contenant les cellules a été remis en suspension dans 300 μL de tampon de lyse SDS (1 % (wt/vol) SDS, 10 mM EDTA et 50 mM Tris–HCl , pH 8) additionné d'un inhibiteur de protéase. La chromatine a été soniquée dans un tampon de lyse SDS à une amplitude de 60 % pendant 8 min (20 s allumé, 20 s éteint, sonicateur Qsonica 700 fourni avec un cornet 431C2); ces paramètres nous ont permis d'obtenir des fragments de ~ 300 pb. Après sonication, les échantillons ont été centrifugés à 12 800 tr/min pendant 10 min à 4 °C, et le surnageant contenant la chromatine soniquée a été transféré et dilué à l'aide de 1,7 mL du tampon suivant : 0,01 % (1,1 % (vol/vol) Triton X-100 , EDTA 1,2 mM, Tris-HCl 16,7 mM, NaCl 167 mM). Une solution contenant 20 μL de Dynabeads (10002D, Invitrogen) et un anticorps spécifique de la cible d'histone a été ajoutée aux tubes d'échantillon et incubée pendant une nuit à 4 °C. Avant d'ajouter l'anticorps et les Dynabeads, 10 μL de chaque échantillon ont été prélevés comme « échantillons d'entrée » (matériel de départ).

Après une nuit d'incubation avec des Dynabeads et l'anticorps d'intérêt, les billes ont été lavées 5 min chacune avec les quatre tampons suivants : (1) tampon à faible teneur en sel : 0,1 % (wt/vol) SDS, 1 % (vol/vol) Triton X -100, EDTA 2 mM, Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM ; (2) tampon à haute teneur en sel : 0,1 % (wt/vol) SDS, 1 % (vol/vol) Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8, 500 mM NaCl ; (3) Tampon LiCl : 0,25 M LiCl, 1 % (vol/vol) Igepal, 1 mM EDTA, 10 mM TrisCl, pH 8, 1 % (poids/vol) acide désoxycholique ; et (4) tampon TE (deux lavages).

Après les étapes de lavage, les billes ont été traitées deux fois avec une solution de 50 μL contenant 1 % (wt/vol) SDS et 0,1 M NaHCO3, pH 9, et ont été incubées à 65 °C pendant 15 min pour éluer la chromatine précipitée de les perles. Par la suite, la chromatine éluée a été réticulée en inverse en ajoutant 9 μL de NaCl 5 M et en incubant à 65 ° C pendant 4 h. Ensuite, les protéines ont été éliminées en ajoutant de la protéinase K et en incubant les échantillons pendant 1 h à 45 °C. L'ADN précipité a été purifié avec un kit MiniElute Reaction Clean-Up (Qiagen) et la concentration d'ADN a été mesurée à l'aide d'un système QuantiFluor dsDNA (Promega). Un minimum de ~ 5 ng d'ADN a été obtenu.

Des quantités égales d'ADN précipité (0,4 ng) et d'échantillons d'entrée ont été utilisées pour l'analyse qPCR (0,1 ng/μL). La PCR quantitative a été réalisée comme expliqué précédemment. Les valeurs d'expression normalisées ont été calculées avec le programme interne CFX Manager, fourni par la machine 384 CFX Bio-Rad en utilisant la région située loin du promoteur comme gène de référence. Nous avons utilisé la région dans GAPDH pour la normalisation H3K4me3-ChIP et RPLP0 pour H3K9me3-ChIP. L'enrichissement de chaque cible dans l'ADN précipité a été évalué en calculant le rapport entre la moyenne des copies d'ADN de puce normalisées et la moyenne des copies d'ADN normalisées dans les entrées.

Le contrôle qualité des lectures a été effectué avec FastQC v0.11.7. Les informations de lecture de séquençage sont présentées dans le tableau S2. Le nombre de lectures par échantillon est indiqué. Les lectures ont été alignées sur la référence GRCh38 humaine à l'aide de Bowtie (v1.2.3)45 (paramètres de ligne de commande : -m1-best-strata-v3), triées à l'aide de SAMtools (v1.13)46 et directement converties en fichiers binaires (BAM). Les lectures en double de la PCR ont été marquées et supprimées à l'aide de SAMtools. Pour la visualisation des pistes ChIP-seq, les pistes Bedgraph ont été générées à l'aide de la fonction GenomeCoverageBed de BEDtools version v2.27.147. IGV a été utilisé pour visualiser les pistes48.

L'enrichissement différentiel des régions H3K4me3 dans les groupes de contrôle et de traitement a été réalisé à l'aide du package csaw (v1.26.0)49. Tout d'abord, nous avons compté le nombre de lectures dans le génome complet à l'aide de windowCounts() avec les paramètres spacing = 50, width = 150 et bin = FALSE. Ensuite, les facteurs de normalisation ont été calculés à l'aide de normFactors (). Ensuite, estimateDisp () et glmQLFit () du package edgeR (v3.34.0)50 ont été utilisés pour calculer le changement log2 fois, la valeur p et le FDR des régions différentielles. Les régions significativement différentielles ont été sélectionnées avec FDR < 0,05.

RCircos de R (version_1.2.2) a été utilisé pour générer une carte thermique Circos pour les valeurs de changement de pli log2 normalisées51. La carte à bulles d'annotation de la fonction génique a été générée par un script R fait maison avec un codage couleur : plus la couleur est foncée, plus la valeur p est petite. La taille du point représente la proportion de gènes.

Les séquences masquées répétées des régions H3K4me3 différentielles ont été réalisées par RepeatMasker52 version open-4.0.9. L'identification du motif a été réalisée à l'aide de MEME-ChIP24 avec les paramètres par défaut. Les motifs identifiés ont été comparés à des motifs connus à l'aide de TomTom53, et Find Individual Motif Occurrences (FIMO) a été utilisé pour rechercher des sites de liaison de motifs54.

Les régions différentielles ont été analysées par GREAT55 qui a attribué les régions ChIP-seq aux gènes. La liste des gènes a été soumise à DAVID56,57. Nous avons effectué l'analyse en utilisant l'option "graphique d'annotation fonctionnelle" de DAVID, où nous avons choisi "GOTERM_BP_DIRECT" avec les paramètres par défaut.

Des souris suisses consanguines (RjOrl:SWISS) ont été achetées au laboratoire Janvier. Les souris ont été gardées dans une animalerie dans des conditions standard d'animalerie. Après la reproduction, le jour de la détection du bouchon vaginal a été considéré comme le jour embryonnaire 0,5 (E0,5). Les femelles gestantes ont été disséquées au jour de gestation E15.5 lorsque le placenta est bien développé. Des animaux d'au moins trois portées indépendantes ont été utilisés pour toutes les expériences.

Pour l'analyse de l'ARN, les placentas de 4 souris gravides à E15 ont été disséqués. Le sexe du placenta a été déterminé en analysant les gonades d'embryons correspondants. L'ARN total a été extrait à l'aide d'un kit RNeasy Plus Mini (Qiagen) conformément aux instructions du fabricant. Ce kit comprend une étape d'élimination de l'ADN. La transcription inverse a été réalisée avec 1 µg d'ARN à l'aide d'un kit de synthèse d'ADNc iScript™ (Bio-Rad). L'ADNc résultant a été dilué 10 fois et utilisé pour une RT‒qPCR quantitative. Les séquences d'amorces utilisées pour la RT‒qPCR sont présentées dans le tableau supplémentaire S3. La RT‒qPCR a été réalisée à l'aide d'iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) conformément aux instructions du fabricant sur un système de détection PCR en temps réel CFX384 Touch (Bio-Rad). Les valeurs du cycle de quantification (Cq) ont été calculées à l'aide du programme interne CFX Manager, fourni par la machine 384 CFX Bio-Rad. Les valeurs Cq de l'ADNc Rpl37a ont été utilisées pour la normalisation. Les données ont été analysées et sont présentées sous forme de valeurs moyennes de changement de facteur (FC) par rapport au contrôle ± SD, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Pour l'immunocoloration, les placentas des mâles ou des femelles ont été fixés dans une solution de PFA à 4 % (p/v) pendant 16 h, déshydratés et inclus dans de la paraffine. Les coupes ont été déparaffinées et réhydratées, et les épitopes ont été démasqués dans un tampon citrate 0,01 M, pH 6, à 80°C pendant 45 min. Après lavage dans 1X PBS-0,05% Tween (PBS-T), les coupes ont été incubées avec un anticorps de lapin anti-H3K4me3 (1:500, Merck Millipore, 07-473). Les coupes avec l'anticorps H3K4me3 primaire (1:500, Millipore 07-473) ont été incubées dans du PBS-T pendant une nuit à 4°C dans une chambre humidifiée. Après lavage dans du PBS-T, les coupes ont été incubées avec des anticorps secondaires fluorescents appropriés (1:500) pendant 1 h dans une chambre humidifiée à température ambiante. Les coupes ont été contre-colorées avec du dichlorhydrate de 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à 0,001 % (v/v) et montées à l'aide de la solution VECTASHIELD. Les images ont été obtenues à l'aide d'un microscope AxioImager équipé d'une caméra AxioCam MRc5 et du logiciel AxioVision version 4.8.2 (Zeiss, Allemagne) avec un objectif 20 ×. Nous avons analysé un minimum de 6 images par répétition et quantifié l'intensité du signal dans les cellules à l'aide d'ImageJ v1.52n. Nous avons soustrait le fond en utilisant des régions sans cellules. L'intensité moyenne de H3K4me3 a été mesurée, normalisée à l'intensité du signal de DAPI et calculée comme la fluorescence moyenne normalisée.

Nous avons classé les concentrations urinaires en deux groupes : valeurs non détectées et détectées dans les échantillons d'urine pour DE et en dessous et au-dessus des valeurs médianes pour DM. Le test de Mann-Whitney a été utilisé pour comparer les associations entre les deux groupes. Pour renforcer nos résultats et contrôler les caractéristiques maternelles susceptibles d'affecter la fonction placentaire, nous avons en outre réalisé des modèles de régression linéaire multivariable pour les associations observées avec le test de Mann-Whitney. Nous avons donc appliqué des régressions linéaires multivariées en considérant l'âge maternel, l'indice de masse corporelle (> 25 vs ≤ 25 kg/m2) et le tabagisme (oui vs non) comme variables indépendantes dans les modèles.

Les procédures de recherche ont été approuvées par le comité d'éthique pour les études biomédicales impliquant des sujets humains. Un consentement éclairé a été obtenu de tous les participants et/ou de leur tuteur légal. Les sujets adultes ont donné leur consentement éclairé par écrit et les enfants de 6 ans ont donné leur consentement verbal et assisté. Le comité d'éthique de la Commission Nationale pour la Confidentialité de l'Informatique a approuvé toutes les procédures d'étude (n° 902076).

Toutes les procédures expérimentales utilisant des animaux ont été autorisées par le ministère de l'Éducation nationale et de la Recherche de France (numéro APAFIS # 17473-2018110914399411 v3). L'animalerie utilisée pour la présente étude est agréée par le Ministère de l'Agriculture (agrément D35-238-19). Toutes les procédures expérimentales ont suivi les principes éthiques énoncés dans le Guide du ministère de la Recherche pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le comité local d'éthique de l'expérimentation animale (C2EA-07). Toutes les méthodes étaient conformes aux directives ARRIVE.

Toutes les données de séquençage et de ChIP-seq de cette étude sont accessibles au public et ont été déposées au National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus. Le numéro GEO est GSE209943. Les ensembles de données étayant les conclusions de cet article sont disponibles dans le référentiel [GEO], [GSE209943] et un lien hypertexte vers les ensembles de données https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc. cgi?acc=GSE209943.

Organophosphoré

Actine gamma 1

AlkB homologue 3, dioxygénase dépendante de l'alpha-cétoglutarate

Récepteur aux androgènes

BCL2 interagissant avec la protéine 3

Cadhérine 2

Chaîne alpha 1 de collagène de type IV

Chaîne alpha 2 de collagène de type IV

Chaîne alpha 1 de collagène de type V

Phosphate de dialkyle

La base de données pour l'annotation, la visualisation et la découverte intégrée

Origine développementale de la théorie des maladies humaines

Phosphate de diéthyle

Phosphate de diméthyle

Facteur d'initiation de la traduction eucaryote 5

éomésodermine

Enhancer of zeste 2 polycomb complexe répressif 2 sous-unité

Protéine de liaison GATA 3

Outil d'enrichissement des régions génomiques des annotations

Biosurveillance humaine pour l'Union européenne

Facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF2)

Homeobox iroquois 3

Suppresseur de métastases KiSS-1

Long élément nucléaire intercalé-1

Meis homeobox 1

EM multiples pour l'élicitation de motifs

Nanog homeobox

Doigt de zinc type Nanos C2HC 3

8-oxoguanine ADN glycosylase

Récepteur alfa activé par les proliférateurs de peroxysomes

Récepteur gamma activé par les proliférateurs de peroxysomes

PR/SET domaine 6

Alpha satellite

Facteur de transcription Sp1

Facteur de transcription Sp2

SUV39H1 histone lysine méthyltransférase

SUV39H2 histone lysine méthyltransférase

Facteur de transcription T-box 2

Facteur de transcription du domaine TEA 4

ARN contenant des répétitions télomériques

Transcriptase inverse de la télomérase

Transcriptase inverse de la télomérase

Récepteurs alpha des hormones thyroïdiennes

Facteur de nécrose tumoral

Facteur de croissance endothélial vasculaire A

Facteur de croissance endothélial vasculaire A

Doigt de zinc endothélial vasculaire 1

Transcription spécifique X inactive

Protéine à doigt de zinc liée à l'Y

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Le séquençage a été réalisé par la plateforme GenomEast, membre du consortium "France Génomique" (ANR-10-INBS-0009). Nous remercions les sages-femmes, les obstétriciens, les gynécologues, les échographistes, les pédiatres, les psychologues et toutes les familles qui ont participé à l'étude PELAGIE.

Ce travail a été soutenu par un financement de la Fondation de France à Cécile Chevrier et Johanna Lepeule. Chunxiang HAO a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31801061). Les auteurs remercient le programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne HBM4EU pour son soutien financier SCD et MC.

Les auteurs suivants ont contribué à parts égales : Martina Capriati, Chunxiang Hao et Shereen Cynthia D'Cruz.

Univ. Rennes, EHESP, Inserm, Irset (Institut de Recherche en Santé, Environnement et Travail) - UMR_S 1085, 35000, Rennes, France

Martina Capriati, Shereen Cynthia D'Cruz, Christine Monfort, Cécile Chevrier, Charline Warembourg & Fatima Smagulova

École de médecine, Université de Linyi, Linyi, 276000, Chine

Chunxiang Hao

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FS et CC ont conçu la recherche. SCD et FS ont extrait l'ADN génomique. MC, FS et SCD ont effectué des expériences ChIP. MC a effectué une analyse WB. MC et FS ont généré les bibliothèques ChIP-seq. CH a analysé les données de séquençage. FS a réalisé la morphologie du placenta murin, l'immunofluorescence et l'analyse RT‒qPCR. CW a effectué une analyse statistique des données. MC, FS, SCD, CC ont rédigé le manuscrit. CW, CH, MC ont préparé des chiffres. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Fatima Smagulova.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Capriati, M., Hao, C., D'Cruz, SC et al. Analyse à l'échelle du génome des différences spécifiques au sexe dans la cohorte PELAGIE mère-enfant exposée aux métabolites organophosphorés. Sci Rep 13, 8003 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35113-8

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Reçu : 06 octobre 2022

Accepté : 12 mai 2023

Publié: 17 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-35113-8

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