Les dérivés d'Ebselen inhibent le SRAS

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9161 (2023) Citer cet article

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Les protéases codées par le SARS-CoV-2 constituent une cible prometteuse pour de nouvelles thérapies contre le COVID-19. La protéase principale du SRAS-CoV-2 (Mpro, 3CLpro) et la protéase de type papaïne (PLpro) sont responsables du clivage de la polyprotéine virale, un processus crucial pour la survie et la réplication virales. Récemment, il a été démontré que le 2-phénylbenzisosélénazol-3(2H)-one (ebselen), un médicament anti-inflammatoire à petite molécule d'organosélénium, est un puissant inhibiteur covalent des protéases et sa puissance a été évaluée dans des dosages enzymatiques et antiviraux. Dans cette étude, nous avons passé au crible une collection de 34 dérivés d'ebselen et de diséléniure d'ebselen pour les inhibiteurs SARS-CoV-2 PLpro et Mpro. Nos études ont révélé que les dérivés d'ebselen sont de puissants inhibiteurs des deux protéases. Nous avons identifié trois inhibiteurs de PLpro et quatre de Mpro supérieurs à l'ebselen. Indépendamment, il a été démontré qu'ebselen inhibe l'activité N7-méthyltransférase de la protéine nsp14 du SRAS-CoV-2 impliquée dans la modification de la coiffe de l'ARN viral. Par conséquent, des composés sélectionnés ont également été évalués en tant qu'inhibiteurs de nsp14. Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons utilisé 11 analogues d'ebselen - bis (2-carbamoylaryl) phényl diséléniures - dans des tests biologiques pour évaluer leur activité anti-SARS-CoV-2 dans les cellules Vero E6. Nous présentons leur activité antivirale et cytoprotectrice ainsi qu'une faible cytotoxicité. Nos travaux montrent que l'ebselen, ses dérivés et ses analogues disélénides constituent une plateforme prometteuse pour le développement de nouveaux antiviraux ciblant le virus SARS-CoV-2.

Au cours de l'hiver 2019, une épidémie de pneumonie avec des symptômes pseudo-grippaux est apparue à Wuhan, en Chine1,2. Peu de temps après, l'agent pathogène à l'origine de la maladie a été isolé et analysé, ce qui a conduit à l'identification du nouveau bêta-coronavirus humain hautement contagieux SARS-CoV-2 (anciennement connu sous le nom de 2019-nCoV)3. En février 2023, avec plus de 674 millions de personnes diagnostiquées avec la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), le nombre de décès dépassait 6,86 millions de patients dans le monde4. Les vaccins COVID-19 nouvellement développés reposent sur l'immunogénicité de la protéine de pointe virale (S), mais l'émergence de nouveaux variants préoccupants (VOC) du SRAS-CoV-2 met en évidence le besoin de nouveaux antiviraux ciblant les protéines non structurelles (nsps) les plus conservées du virus5,6. Diverses stratégies ont été employées pour accélérer la recherche d'une thérapie efficace pour combattre l'agent pathogène7. L'une de ces stratégies est la réorientation des médicaments, c'est-à-dire l'établissement de propriétés thérapeutiques pour des substances déjà approuvées pour de nouvelles applications médicales. Cette stratégie peut être soutenue par une analyse informatique, qui peut réduire les coûts, accélérer le processus par rapport au développement de novo de nouvelles thérapies et servir de première étape dans le criblage de vastes bibliothèques de composés actifs8,9,10,11,12. Le repositionnement des médicaments a déjà été utilisé dans la lutte contre le COVID-1913. Un exemple ici est le remdesivir, un agent antiviral ciblant l'ARN polymérase virale dépendante de l'ARN (RdRp) qui a été désigné pour traiter Ebola mais qui a montré une efficacité pour raccourcir le temps de récupération et réduire la mortalité ainsi que des effets indésirables graves chez les patients COVID-19 dans les études initiales14. Cependant, après des essais cliniques prolongés, le Consortium d'essais solidaires de l'OMS a conclu que le traitement par le remdesivir n'empêche pas, ou n'empêche qu'une petite fraction des décès chez les patients hospitalisés COVID-19. Dans l'étude, les chercheurs ont également évalué l'efficacité d'autres médicaments réutilisés - l'hydroxychloroquine, le lopinavir et l'interféron bêta-1a. En conséquence, les médicaments n'ont fourni aucun ou peu d'avantages aux patients hospitalisés sans réduction de la durée d'hospitalisation, de la mortalité et de l'initiation de la ventilation15. Récemment, deux médicaments administrés par voie orale ont été introduits sur le marché. Le PF-07321332 (nirmatrelvir) de Pfizer est un inhibiteur du SRAS-CoV-2 Mpro et il est commercialisé en association avec le Ritonavir sous le nom de paxlovid (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04960202 ; [consulté le 21 septembre 2021]). Le deuxième médicament, le molnupiravir développé par Merck et Ridgeback Biotherapeutics, est un inhibiteur de l'ARN polymérase virale dépendante de l'ARN (RdRp) (https://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04939428 ; [consulté le 21 septembre 2021]). Malgré cela, les options de traitement actuelles sont extrêmement limitées et trouver de nouvelles thérapies pour les patients atteints de COVID-19 constitue un défi majeur pour la communauté scientifique.

Pour résoudre le problème, les scientifiques ont identifié des cibles médicamenteuses parmi les protéines virales non structurelles, dont deux sont des protéases. La protéase principale du SRAS-CoV-2 (Mpro, 3CLpro, nsp5) et la protéase de type papaïne (PLpro, domaine de protéase de type papaïne nsp3) permettent la réplication virale dans les cellules hôtes en traitant la polyprotéine virale et en générant 16 nsps, cruciales pour la réplication du virus. Le SARS-CoV-2 Mpro génère 13 nsps virales, ce qui en fait un acteur clé dans le processus de réplication et de maturation du virus16,17,18. Mpro est une cystéine protéase avec une structure hautement conservée parmi les coronavirus humains. En solution, l'enzyme existe à la fois sous forme de monomères et d'homodimères, mais seule la forme homodimérique de la protéase possède la pleine activité catalytique18,19,20,21. Une préférence inhabituelle pour un résidu glutamine en position P1 du site de clivage du substrat distingue Mpro des protéases humaines connues. Cette caractéristique peut être bénéfique pour la conception et la synthèse d'agents antiviraux efficaces à large spectre avec un minimum d'effets secondaires9,18,19,21,22,23. Le SARS-CoV-2 PLpro est une protéase à cystéine virale proposée comme une excellente cible pour le traitement du COVID-19 en raison de ses rôles physiopathologiques. PLpro traite les polyprotéines virales pour générer des protéines nsp1–3. De plus, la protéase modifie également la réponse immunitaire de l'hôte en désubiquitinant et désISGylant les protéines dans les cellules infectées24,25,26,27. Ainsi, l'inhibition de PLpro bloquerait non seulement la réplication du virus, mais limiterait également la dérégulation de la signalisation cellulaire médiée par l'ISG15 et l'ubiquitine.

Le 2-phénylbenzisosélénazol-3(2H)-one (ebselen), d'abord préparé par Lesser et Weiß en 192428, est un médicament à petite molécule avec un mode d'action pléiotrope dans les cellules29. Ebselen est un excellent piégeur de ROS qui agit comme un imitateur de la sélénoenzyme glutathion peroxydase (GPx) et interagit avec le système de thiorédoxine (Trx) par oxydation du TrxR réduit30,31,32. Au cours de l'activité de type GPx, l'ebselen subit une série de réactions organisées en cycles catalytiques. Les données suggèrent que le mode de réaction dépend des concentrations cellulaires de thiols et de peroxyde d'hydrogène30,33,34,35,36,37. Récemment, il a été montré qu'ebselen inhibe les deux protéases du SARS-CoV-2. Weglarz-Tomczak et al. ont évalué l'ebselen et une collection de ses dérivés en tant qu'inhibiteurs du PLpro, conduisant à l'identification d'inhibiteurs avec des valeurs IC50 dans la gamme nanomolaire38. Ebselen et ses dérivés ont également été employés dans une étude d'Amporndanai et al., qui ont étudié l'efficacité inhibitrice de ces composés contre le SARS-CoV-2 Mpro et ont proposé un mécanisme de sélénation catalytique de Cys145 de l'enzyme39. Les composés testés ont présenté des valeurs IC50 sous-micromolaires dans les dosages enzymatiques recombinants et une activité anti-SARS-CoV-2 avec une CE50 dans la plage micromolaire basse dans les dosages cellulaires. De plus, dans les tests antiviraux, les dérivés d'ebselen étaient supérieurs à l'ebselen. Dans une autre étude, une bibliothèque d'environ 10 000 médicaments et candidats-médicaments a été criblée pour les inhibiteurs de Mpro. En conséquence, l'ebselen a affiché l'IC50 la plus faible parmi les substances testées (0,67 µM), en outre, il a également affiché un effet antiviral dans les cellules Vero infectées par le SARS-CoV-29. Dans une étude de Cao et al. les chercheurs ont effectué le HTS de la bibliothèque de composés de la NIH Clinical Collection. Ebselen figurait parmi les agents anticoronaviraux les plus puissants dans les essais cellulaires40. Dans une étude menée par Mangiavacchi et al., il a été montré que l'introduction d'un atome de sélénium dans la structure d'un dérivé de la quercétine augmente son pouvoir antiviral de près de 24 fois par rapport à la quercétine, indiquant l'importance des composés organosélénium dans la découverte de nouveaux antiviraux41.

Des études récentes ont révélé qu'ebselen inhibe également les activités de l'ARN cap guanine N7-méthyltransférase42 et de l'exonucléase43 nsp14 du SRAS-CoV-2. Nsp14 est une enzyme bifonctionnelle avec un domaine N7-méthyltransférase (N7-MTase) fonctionnant indépendamment et un domaine exonucléase dépendant de nsp1044. L'enzyme est impliquée dans le coiffage de l'extrémité 5' des ARNm viraux nouvellement synthétisés, ce qui est crucial pour la stabilité du transcrit viral et la biosynthèse des protéines. Le rôle de la nsp14 N7-MTase est de catalyser la réaction de transfert du groupe méthyle de la S-adénosyl-l-méthionine (SAM) sur la position N7 de la guanosine 5′-triphosphate située à l'extrémité 5′ de l'ARN (Gppp – ARN), entraînant la formation de cap-043. Il a déjà été démontré que l'inhibition des N7-MTases virales supprime la réplication virale45, y compris celle du SARS-CoV44. Ainsi, l'enzyme nsp14 est considérée comme une bonne cible pour le développement de médicaments antiviraux (Fig. 1)46.

Cycle de vie simplifié du SRAS-CoV-2. Le virus pénètre dans la cellule d'un hôte et libère son génome dans le cytoplasme. L'ARN viral est traduit en deux polyprotéines : pp1a et pp1ab. Ensuite, grâce à l'autoclivage, deux protéases virales (PLpro et Mpro) sont libérées. Leur rôle principal est de poursuivre le traitement des polyprotéines, ce qui entraîne la libération d'autres nsps. Ensuite, un groupe de nsps forme des complexes de réplication et de transcription (RTC). Les RTC sont en outre impliqués dans une génération de copies d'ARN génomique viral (ARN-g), ainsi que dans un ensemble d'ARN sous-génomiques (ARN-sg) responsables de la synthèse de protéines virales structurales et accessoires. Les virions sont assemblés dans des compartiments intermédiaires réticulum endoplasmique-Golgi (ERGIC). L'ARNg est recouvert de protéine N structurelle et pénètre dans l'ERGIC contenant les glycoprotéines M, E et S. Ensuite, les virions sont libérés par exocytose47,48. L'inhibition de Mpro, PLpro et N7-MTase peut conduire à la suppression de la réplication du virus. L'inhibition de la protéase arrête la génération de nsps, tandis que l'inhibition de la N7-MTase empêche la synthèse de transcrits stables de l'ARN viral. Créé avec BioRender.com.

L'efficacité de l'ebselen et d'autres composés organosélénium a déjà été évaluée pour les infections par le VIH49,50, le HSV251, le VHC52 et le virus Zika53. Par ailleurs, un rapport récent présente l'ebselen et ses dérivés comme de puissants inhibiteurs du SARS-CoV-2 PLpro38. Actuellement, ebselen est évalué dans un essai clinique de phase 2 en tant que thérapeutique orale chez les patients COVID-19 modérés et sévères (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04484025 ; https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04483973 ; [consulté le 10 août 2021]). Dans ce travail, nous avons étudié les dérivés et analogues d'ebselen en tant qu'agents potentiels anti-SARS-CoV-2. La faible toxicité d'Ebselen et les essais cliniques en cours en font un composé phare attractif. Tout d'abord, nous avons passé au crible une collection de 23 dérivés d'ebselen et de 11 dérivés de diséléniure d'ebselen et déterminé les valeurs de la concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) pour les 2-phénylbenzisosélénazol-3(2H) les plus prometteurs afin d'évaluer leurs propriétés en tant qu'inhibiteurs du SARS-CoV-2 PLpro et Mpro. Ensuite, en utilisant un test de fluorescence Py-FLINT, nous avons évalué les propriétés inhibitrices de la nsp14 N7-MTase pour des dérivés d'ebselen sélectionnés contre l'enzyme recombinante. La "forme ouverte" d'Ebselen - bis[2-(N-phénylcarbamoyl)phényl]diséléniure - est proposée comme l'un des intermédiaires au cours des cycles catalytiques d'ebselen dans les organismes vivants (voir Fig. 2) et dans l'environnement cellulaire, le composé pourrait agir comme réservoir de benzisosélénazolones correspondantes qui inhibent les enzymes virales et participent à la protection contre H2O2 et d'autres ROS54. Par conséquent, nous avons déterminé l'activité anti-SRAS-CoV-2 dans un test basé sur la réduction de l'ARN et des tests basés sur l'effet cytopathique dans les cellules Vero E6 pour 11 bis[2-(N-arylcarbamoyl)phényl]diséléniures. Enfin, nous montrons que l'ebselen peut constituer un composé phare potentiel pour le développement de nouveaux agents antiviraux avec une action cytotoxique minimale in vivo. Les résultats peuvent être utiles dans la conception de nouveaux composés actifs ciblant les protéases codées par le SRAS-CoV-2, à appliquer dans le traitement du COVID-19.

Cycle catalytique plausible de l'ebselen impliquant la réduction du peroxyde d'hydrogène, y compris la formation de la forme ouverte de l'ebselen (couleur bleu foncé)33,37.

La synthèse de composés organosélénium biologiquement actifs est à la portée de nombreuses équipes de recherche à travers le monde35,55,56. L'Ebselen et d'autres benzisosélénazol-3(2H)-ones ont déjà été préparés de plusieurs manières57,58. Les structures des composés inclus dans la collection sont présentées dans le tableau 1. La procédure générale de préparation de l'ebselen, de ses dérivés (1–23) et de leurs analogues (24–34) est présentée à la Fig. Dans les étapes suivantes, les réactions du diséléniure 36 avec le chlorure de thionyle dans le benzène en présence de DMF au reflux du solvant ont produit du chlorure de 2-(chloroséléno)benzoyle (37) ou du diséléniure de bis[(2-chlorocarbonyl)phényl] (38) selon les quantités de chlorure de thionyle utilisées. La réaction de sélénénylation/acylation en tandem59 de l'aniline ou de ses dérivés substitués sur le cycle phényle avec du chlorure de 2-(chloroséléno)benzoyle (37) dans du MeCN anhydre, ou DCM, en présence d'une base Et3N sèche a donné l'ebselen et ses dérivés 1–23. La réaction d'acylation des anilines substituées par le cycle phényle avec le chlorure 38 dans du DCM anhydre en présence de Na2CO3 anhydre comme base a donné les analogues de forme «dimère» d'ebselen 25–3460. En particulier, le diséléniure de carbamoylphényle 24 a été préparé par réduction d'ebselen avec du monohydrate d'hydrazine dans du méthanol comme solvant61. La pureté des composés était> 95% comme confirmé par analyse LC – MS (voir Informations supplémentaires).

Préparation d'ebselen, de ses dérivés et de leurs analogues de forme « dimérique » 1–33. Réactifs et conditions : (a) (i) aq. HCl, (ii) NaNO2, − 7 à + 7 °C, (b) (i) NaSeSeNa, MeOH, NaOH ou LiSeSeLi, THF, HMPTA, − 7 à + 5 °C, (ii) aq. HCl, (c) 7 équiv SOCl2, cat. (DMF), benzène, reflux, (d) RNH2, Et3N, MeCN ou DCM, (e) 3,5 équiv SOCl2, cat. (DMF), benzène, reflux, (f) RNH2, Na2CO3, DCM, (g) H2N-NH2∙H2O, MeOH, reflux. (Effectué conformément aux Réfs.60,62,63,64.

Les spectres FT-IR ont été mesurés dans le réseau cristallin ou dans KBr et les spectres 1H-, 13C-, 77Se- et 19F-NMR ont été généralement mesurés dans DMSO-d6. Pour l'ebselen et ses analogues 1–23, les nombres d'onde correspondant à la vibration d'étirement des groupes carbonyle (C=O) étaient d'environ 1583–1649 cm−1, les liaisons simples carbone azote avec les bandes de substituant (CN) étaient de 1305–1363 cm−1 et le C–Se de 727–747 cm−1. 0. Dans la région benzisosélénazol-3(2H)-one des spectres RMN mesurés dans le DMSO-d6, les résonances des protons H-4, H-5, H-6 et H-7 du composé 1–23 ont été observées à : 7,85–7,94, 7,45–7,51, 7,52–7,78 et 8,05–8,12 ppm, respectivement, et le carbone C=O, Les résonances C-3′, C-4, C-5, C-6, C-7 et C–Se ont généralement été observées à 164,87–166,08, 126,43–128,53, 127,73–128,22, 126,06–126,52, 132,07–133,01, 125,71–126,07 et 138,50–140,59 ppm, respectivement, tandis que l'atome de carbone d'un substituant phényle lié à une résonance hétéroaromatique (PhC-1) a été observé à 119,7–146,3 ppm, en fonction des substituants utilisés. La résonance 77Se-RMN des benzisosélénazolones (1–33 observés à 914,33–974,90 ppm) et des diséléniures (25–34 observés à 443,48–447,93 ppm) est en accord avec les données publiées précédemment64,65,66. Pour les benzisosélénazolones 1, 14, 15, 17 et 5, nous avons trouvé des constantes de couplage spin–spin du fluorure de sélénium 4J(77Se–19F) et 5J(77Se–19F) de 15,1–25,5 Hz et 10,7 Hz, respectivement. Aucune constante de spin–spin 6–7J(77Se–19F) n'a été mesurée.

Premièrement, nous avons évalué les propriétés inhibitrices de l'ebselen et des composés 1 à 23 à une concentration d'inhibiteur de 1 µM avec 100 nM de SARS-CoV-2 PLpro et à une concentration d'inhibiteur de 100 nM avec 100 nM de SARS-CoV-2 Mpro. Pour le PLpro, nous avons utilisé un substrat fluorogène Ac-LRGG-ACC avec une structure basée sur l'épitope C-terminal des protéines Ub et ISG15 ainsi que sur les sites de clivage nsp1/2, nsp2/3 et nsp3/4 dans la polyprotéine coronavirale. Pour le Mpro, nous avons utilisé un nouveau substrat fluorogène tétrapeptidique, QS1 (Ac-Abu-Tle-Leu-Gln-ACC ; KM = 207,3 ± 12 µM, kcat/KM = 859 ± 57 M−1 s−1)22. Le dépistage PLpro a permis d'identifier uniquement la benzisosélénazolone 7 avec une puissance supérieure à celle de l'ebselen. Cependant, le composé 7 différait des autres composés de la collection car il s'agissait du seul dérivé d'ebselen étudié avec un fragment pyridinyle 3-substitué au lieu d'un cycle phényle substitué. Pour le Mpro, les meilleurs résultats étaient les composés 10 et 17. Le composé 10 représente des dérivés monosubstitués avec un groupe nitro en position para, tandis que 17 est un dérivé avec des substitutions 2-fluoro et 5-chloro dans le cycle aromatique. Nous avons observé que le dérivé 2,4-diméthoxy 16 présente une puissance vis-à-vis des deux protéases proche de celle de l'ebselen, cependant, en comparaison avec l'ebselen, sa toxicité évaluée dans la lignée cellulaire humaine A549 était 10 fois plus faible60. En général, les substitutions au sein du cycle phényle de l'ebselen renforcent l'inhibition de Mpro car nous n'avons identifié que 3 composés (6, 7 et 12) avec une puissance inférieure à celle de l'ebselen. Voir le tableau S2 dans les informations supplémentaires pour les résultats du dépistage39.

Sur la base des résultats du criblage, nous avons sélectionné l'ebselen et sept de ses dérivés pour une évaluation plus approfondie des propriétés inhibitrices dans les dosages IC50. Nous avons choisi les composés : (a), présentant la plus grande puissance vis-à-vis de Mpro (10, 17) ou PLpro (7) lors du criblage ; ou (b), présentant une inhibition relativement élevée vis-à-vis des deux protéases étudiées (3, 16, 20, 21). Au cours des essais, les valeurs IC50 pour PLpro étaient dans la gamme micromolaire tandis que pour Mpro, elles étaient dans la gamme nanomolaire basse. Les résultats sont présentés dans le tableau 2. Pour l'inhibiteur de référence, l'ebselen, les valeurs de CI50 étaient de 1,12 ± 0,06 µM pour PLpro et de 30,91 ± 2,67 nM pour Mpro. Le composé 7, qui a été le plus touché dans le test de dépistage des inhibiteurs PLpro, avait en effet la valeur IC50 la plus faible (0,58 ± 0,04 µM) parmi les composés testés. Bien qu'ebselen soit le deuxième meilleur inhibiteur de PLpro dans le test de dépistage, nous avons constaté que deux autres composés (17, 21) affichaient des valeurs IC50 légèrement inférieures. Les composés 10 et 17, qui ont été sélectionnés pour l'analyse comme les meilleurs inhibiteurs de Mpro, ont affiché des valeurs IC50 inférieures à celles de l'ebselen. L'inhibiteur de Mpro le plus puissant avec IC50 = 15,24 nM était le composé 17, le deuxième meilleur résultat de l'expérience de criblage. Fait intéressant, le meilleur coup 10 a affiché une valeur IC50 similaire aux valeurs déterminées pour 3 et 21 (27,95 nM, 25,69 nM et 27,37 nM respectivement). Pour 16 et 20, nous avons observé que malgré une puissance plus élevée dans le test de dépistage, les valeurs IC50 déterminées pour ces composés étaient plus élevées que pour l'ebselen.

IC50 est une mesure dépendante du dosage. Les faibles valeurs d'IC50 obtenues pour les composés sont probablement dues aux propriétés des substrats utilisés. Le SARS-CoV-2 PLpro possède une activité de désubiquitination et le substrat Ac-LRGG-ACC utilisé a une valeur kcat/KM relativement faible (kcat/KM ≈ 900 s−1 M−1). Les substrats optimaux pour cette enzyme sont à base d'ubiquitine ou de molécules ISG1526. Pour le SARS-CoV-2 Mpro, nous avons utilisé notre nouveau substrat fluorogène tétrapeptidique QS1, qui a une valeur kcat/KM inférieure (kcat/KM = 859 s−1 M−1) par rapport aux substrats FRET22.

Des analogues d'ebselen sélectionnés - 3, 7, 10, 16 et 17 ont été testés plus avant pour leurs propriétés inhibitrices de la nsp14 N7-MTase. Pour déterminer leurs valeurs IC50, nous avons utilisé le test de fluorescence décrit précédemment Py-FLINT42,67. À cette fin, la sonde Py-FLINT (1 μM) a été incubée avec un cosubstrat SAM (20 μM), l'enzyme nsp14 (40 nM) et des dilutions d'inhibiteur demi-log dans un tampon Tris – HCl pH 7, 5 50 mM à 30 ° C. La progression de la réaction a été surveillée dans des cellules à 96 puits en enregistrant le signal d'intensité de fluorescence avec un intervalle de temps de 1 minute. En utilisant l'évolution de la réaction initiale, les valeurs des vitesses initiales V ont été calculées. Pour calculer les valeurs IC50 à partir des dépendances obtenues des taux initiaux par rapport à la concentration d'inhibiteur, nous avons ajusté une équation dose-réponse à quatre paramètres, en supposant une pente de Hill variable p (tableau 3, figure S2).

Des valeurs élevées de la pente de la colline ont été observées pour les inhibiteurs les plus puissants (composés 3, 7 et contrôle ebselen) et nous supposons qu'elles résultent des limites de la méthode fluorescente appliquée. La plage d'inhibition qui peut être étudiée dans une expérience de compétition est limitée par l'affinité de la sonde fluorescente pour la protéine. Nous pensons qu'un meilleur substrat fluorescent avec une valeur constante de Michelis-Menten plus faible permettrait une meilleure distinction entre les inhibiteurs puissants de nsp14 visibles en p ~ 1. Les composés 3, 7 et 16 avaient des valeurs IC50 comparables à l'ebselen (0, 35 à 0, 42 μM), indiquant qu'ils sont de puissants inhibiteurs de nsp14. Les composés portant des substitutions 4-nitrophényle (10) et 5-chloro-2-fluorophényle (17) avaient des valeurs IC50 supérieures d'un ordre de grandeur (3,08 ± 0,46 μM et 3,83 ± 0,35 μM, respectivement). Les mêmes substitutions ont provoqué une augmentation de la puissance inhibitrice contre Mpro, ce qui implique que les substitutions du cycle phényle sont une voie possible vers l'adaptation de la sélectivité des composés. Dans l'ensemble, les résultats indiquent qu'ebselen et ses dérivés peuvent agir comme des inhibiteurs multi-cibles de l'activité de la protéine SARS-CoV-2.

Pour mieux comprendre l'activité biologique des composés organosélénium, nous avons inclus dans notre étude une collection de 11 diséléniures, des formes ouvertes de divers dérivés d'ebselen. Dans un premier temps, nous avons réalisé un criblage des inhibiteurs PLpro et Mpro selon un protocole employé pour les benzisosélénazol-3(2H)-ones. Le criblage a révélé que les diséléniures inhibent les deux protéases. Les diséléniures ont généralement inhibé Mpro plus faiblement que l'ebselen ; cependant, contrairement aux benzisosélénazolones, pour PLpro, les diséléniures ont affiché une puissance supérieure à celle du composé de référence (pour les résultats de dépistage complets, voir le tableau d'informations supplémentaires S3). Le paramètre IC50 pour l'inhibition de la protéase n'a pas pu être évalué en raison de la forte hydrophobicité des composés et de leur précipitation dans le tampon d'essai. Ensuite, nous avons testé l'activité anti-N7-MTase des diséléniures en utilisant le test Py-FLINT. Tous les composés testés affichaient des valeurs IC50 dans la plage nanomolaire élevée ou micromolaire basse (tableau 4). Nous avons observé que pour le composé 25 avec un cycle phényle 2-fluorosubstitué, l'IC50 est 3 fois plus faible (0,12 ± 0,01 µM) que pour l'ebselen. La "forme dimère" de l'ebselen 24 et de son dérivé 3-fluorosubstitué 27 a également affiché une IC50 environ deux fois inférieure à celle de l'ebselen. Les résultats de ces composés sont en corrélation avec leurs faibles valeurs EC50 dans les dosages basés sur le CPE et l'ARN (tableau 5).

Des tests in vitro avec des enzymes recombinantes ont montré qu'ebselen, ses dérivés et ses analogues possèdent une activité inhibitrice vis-à-vis du SARS-CoV-2 Mpro, PLpro et nsp14. Sachant que le diséléniure d'ebselen participe aux cycles catalytiques de l'ebselen et que le stress oxydatif joue un rôle important dans l'infection par le SARS-CoV-268, nous avons supposé que les analogues d'ebselen - bis(2-carbamoylaryl)phenyl diselenides - pourraient également posséder une activité antivirale dans les cellules. Notre prochaine étape a été l'évaluation des propriétés antivirales et de la cytotoxicité d'analogues d'ebselen sélectionnés in cellulo dans la lignée cellulaire Vero E669. Pour cette expérience, nous avons inclus les formes dimères disponibles de dérivés d'ebselen (structures présentées dans le tableau 5). Pour mieux comprendre l'activité des composés testés, nous avons effectué quatre tests : test basé sur l'effet cytopathique, test basé sur la réduction de l'ARN, test de réduction du titre viral et test de cytotoxicité. Les composés avec une CE50 supérieure à 20 µM dans le test basé sur le CPE ont été exclus des tests basés sur la réduction de l'ARN et de la réduction du titre viral. Nous avons utilisé le remdesivir comme agent contrôle positif anti-SARS-CoV-2. Outre l'ebselen, le CC50 de tous les composés testés dépassait 50 µM, indiquant leur cytotoxicité généralement faible. De plus, ebselen a affiché la deuxième CE50 la plus élevée dans le test basé sur le CPE. Cependant, pour le diséléniure d'ebselen (diséléniure de bis(2-carbamoyl)diphényle, 24), nous avons observé la réponse antivirale la plus forte (EC50 = 1,0 ± 0,14 µM dans le test basé sur la réduction de l'ARN) et le troisième effet cytoprotecteur le plus fort (EC50 = 1,5 ± 0,13 µM dans le test basé sur le CPE). L'effet cytoprotecteur le plus élevé a été observé pour le diséléniure de bis[2-(3-fluorophénylcarbamoyl)]phényle (27), qui était le seul diséléniure avec une EC50 dans la gamme nanomolaire (EC50 = 0,7 ± 0,13 µM). Le composé a également affiché une activité antivirale élevée avec la deuxième CE50 la plus faible (1,5 ± 0,15 µM) dans le test basé sur la réduction de l'ARN. Un autre composé puissant était le 30, avec un cycle phényle substitué par 4-chloro et 2-fluoro, car il affichait la deuxième EC50 la plus basse dans le test basé sur le CPE. Dans la plupart des cas, nous avons observé que pour les diséléniures avec méthyle (32 et 33, avec des homologues chlorés) ou des substituants plus grands (groupes 28, 31-méthoxy et 26, 29-trifluorométhyle), l'effet cytoprotecteur était diminué, mais l'activité antivirale n'a pas changé de manière significative par rapport aux composés avec uniquement des substituants halogénures dans le cycle phényle. Cependant, le composé 34 avec un cycle phényle substitué par 5-chloro-2-fluoro présentait la CE50 la plus élevée dans le test basé sur la réduction de l'ARN et avait une CE50 considérablement plus élevée dans le test basé sur le CPE par rapport aux autres dérivés de diséléniure d'ebselen substitués par un halogénure (25, 27, 30). Nous avons observé que les groupes trifluorométhyle, en particulier, entravaient l'activité des composés, ce qui entraînait les valeurs EC50 les plus élevées dans le test basé sur le CPE. La puissance anti-SARS-CoV-2 des dérivés de diséléniure a été confirmée par la détermination de la réduction maximale du titre viral à la concentration EC90. La réduction du titre viral variait de 0,3 à 3,3 log10PFU/mL, le composé 25 affichant la meilleure réduction du titre viral suivi des composés 24, 34 et 30.

Avec plus de 6,86 millions de décès causés par le COVID-19, le besoin d'une thérapie largement accessible, efficace et sûre contre les maladies coronavirales est crucial pour la santé publique. Une stratégie prometteuse implique l'inhibition de Mpro et cette approche peut conduire à de nouveaux médicaments anticoronaviraux à large spectre18. Récemment, des efforts de réorientation ont permis d'identifier l'ebselen comme un médicament potentiel contre le COVID-19, probablement en raison de son action en tant qu'inhibiteur de la protéase principale du SARS-CoV-29. Ce concept a ensuite été soutenu par Amporndanai et al., qui ont proposé un mécanisme de sélénation du résidu catalytique Cys145 de Mpro par ebselen39. De plus, en utilisant des simulations de dynamique moléculaire, Menéndez et al. exploré les interactions non covalentes entre le Mpro et la molécule d'ebselen. Les chercheurs ont trouvé deux sites d'interaction possibles : l'un situé dans le site actif et le second dans la région impliquée dans la formation des dimères70. Des résultats prometteurs provenant d'études sur l'ebselen en tant qu'agent anti-SRAS-CoV-2 ont inspiré les chercheurs à explorer également ses dérivés en tant qu'antiviraux potentiels. Węglarz-Tomczak et al. ont étudié l'ebselen et ses analogues en tant qu'inhibiteurs de la protéase PLpro38. Qiao et al. a conçu et synthétisé une série de dérivés d'ebselen pour améliorer l'inhibition du SARS-CoV-2 Mpro. Les chercheurs ont identifié trois composés, qui étaient supérieurs à l'ebselen dans les tests d'activité antivirale cellulaire effectués dans les cellules HPAepiC71. Soleil et al. ont étudié l'ebselen, l'ebsulfur et leurs dérivés en tant qu'inhibiteurs de Mpro. Dans des conditions non réductrices, tous les composés présentaient des propriétés inhibitrices. Cependant, l'inhibition a été diminuée dans le test de dépistage dépendant du DTT, ce qui a conduit à la conclusion qu'ebselen est un inhibiteur de la protéase à cystéine promiscueux et que son activité antivirale dans les cellules peut ne pas être le résultat d'une inhibition directe de la protéase. Le rôle de l'ebselen en tant qu'inhibiteur de la protéase a également été remis en question par Ma et al., qui ont montré que l'ebselen se lie de manière non spécifique aux sites actifs de diverses protéases à cystéine en l'absence d'agent réducteur72. Dans une autre étude menée par le groupe Wang, l'ebselen n'a montré aucune inhibition de Mpro dans les cellules lors des tests Protease-Glo luciférase et Flip-GFP. Les auteurs ont effectué un test de substrat FRET in vitro à l'aide d'une enzyme recombinante et ont montré qu'en présence d'un agent réducteur, l'ebselen n'inhibe pas la protéase73. De plus, en utilisant le test Flip-GFP, les chercheurs n'ont observé aucune inhibition du SARS-CoV-2 PLpro par l'ebselen dans les cellules 293T-ACE274. Aucune inhibition cellulaire de Mpro n'a également été signalée par Heilmann et ses collègues, qui ont développé un nouveau test basé sur le VSV pour l'évaluation des inhibiteurs de protéase dans les cellules75.

Ebselen a un mode d'action pléiotrope qui résulte de sa réactivité vis-à-vis des résidus de cystéine affectant de nombreuses cibles biologiques29,31,76. L'une des explications plausibles de l'activité antivirale élevée de l'ebselen et de ses dérivés pourrait être leur fonction de mimétiques des sélénoenzymes GPx, qui sont cruciales pour maintenir de faibles niveaux de ROS (Fig. 2). Le stress oxydatif joue un rôle majeur dans les infections virales77, ainsi, les antioxydants tels que les composés organosélénium peuvent fournir un résultat bénéfique. De plus, l'isoforme GPx1 a été proposée comme substrat cellulaire possible du SARS-CoV-2 Mpro, ainsi la présence d'ebselen dans les cellules contrecarrerait l'épuisement de l'enzyme78. De plus, Du et al. ont montré que l'activité Mpro du SRAS-CoV-2 pourrait être favorisée par le stress oxydatif79. Ainsi, l'activité antioxydante d'ebselen diminuerait indirectement l'activité de SARS-CoV-2 Mpro, cependant, ce concept nécessite des recherches plus approfondies et une confirmation expérimentale.

Les composés organosélénium peuvent présenter une toxicité à des concentrations plus élevées en raison de leur réactivité pan envers les groupes thiol76. Cependant, la sécurité clinique d'ebselen a été prouvée dans de nombreuses études, ce qui fait de cette substance un bon candidat pour une optimisation plus poussée de la structure. Ebselen appartient à la bibliothèque de composés NIH Clinical Collection, qui rassemble des substances qui ne sont pas actuellement utilisées en clinique, mais avec des antécédents d'utilisation dans des essais cliniques chez l'homme. Son efficacité et sa sécurité chez l'homme ont été évaluées dans diverses études. Dans un essai clinique de phase I sur l'ebselen comme traitement potentiel de la perte auditive chez l'homme, les patients ont toléré une dose unique de 1600 mg80. Dans une étude placebo de phase IIa en double aveugle sur l'ebselen dans le traitement de la manie ou de l'hypomanie, le médicament a été administré pendant trois semaines à des doses de 600 mg. En tant que résultat, les effets indésirables dans les deux groupes étaient comparables81. L'administration d'ebselen pendant deux semaines à des doses de 300 mg par jour s'est également avérée sans danger pour les patients souffrant d'un AVC ischémique aigu82. Finalement, en raison de sa pharmacocinétique favorable et de son profil d'innocuité, l'ebselen est étudié comme une alternative plus sûre aux sels de lithium dans le trouble bipolaire83.

Dans notre étude, nous avons utilisé une collection de dérivés et d'analogues d'ebselen pour évaluer leurs propriétés inhibitrices de SARS-CoV-2 PLpro et Mpro. Comme l'ebselen a été identifié comme un puissant inhibiteur de la nsp14 N7-MTase, nous avons également évalué notre série d'analogues de l'ebselen contre le SARS-CoV-2 nsp14. Tout d'abord, nous avons criblé une bibliothèque de composés organosélénium. Ensuite, nous avons déterminé les valeurs IC50 pour les composés sélectionnés. L'inhibiteur de PLpro le plus puissant, le 2-(3-hydroxypyridin-2-yl)-1,2-benzisosélénazol-3(2H)-one, a affiché la puissance la plus élevée dans le test de dépistage et la valeur IC50 la plus faible (0,58 µM). La détermination de la CI50 a permis l'identification de deux autres composés aux propriétés inhibitrices similaires à l'ebselen. Ces composés étaient des dérivés 2,4- et 2,5-disubstitués de l'ebselen qui présentaient une puissance plus faible lors du criblage, mais également des paramètres IC50 légèrement inférieurs à ceux de l'inhibiteur de référence. Une analyse similaire pour le Mpro a permis l'identification de quatre composés affichant une puissance plus élevée lors du dépistage et un paramètre IC50 inférieur. Deux d'entre eux avaient un cycle phényle monosubstitué aux positions para et ortho, et deux étaient des dérivés d'ebselen disubstitués. Le meilleur inhibiteur avec une valeur IC50 environ 2 fois inférieure à celle de l'ebselen était le 2-(5-chloro-2-fluorophényl)-1,2-benzisosélénazol-3(2H)-one. Parmi les dérivés d'ebselen testés, nous avons trouvé des composés avec des modifications 2-bromophényl et 2-(3-hydroxypyridin-2-yl) ayant des propriétés inhibitrices vis-à-vis de nsp14 similaires à l'ebselen.

Une autre partie de la recherche a été l'évaluation de l'activité antivirale et cytoprotectrice de l'ebselen et de ses analogues disélénides. Nous avons testé 12 composés sélénoorganiques et le remdesivir (témoin positif) dans des cellules Vero E6. Des essais basés sur la réduction de CPE et d'ARN ont révélé que cette classe de composés pourrait être une source de candidats prometteurs pour de nouveaux agents antiviraux. La cytotoxicité des diséléniures était généralement faible (CC50 > 50 µM). Nous avons observé que pour le diséléniure d'ebselen et 3 diséléniures sur 4 avec des substitutions d'halogène dans le cycle phényle, la CE50 dans les essais basés sur la réduction CPE était la plus faible. Le diséléniure d'Ebselen a également affiché l'activité antivirale la plus élevée dans le test basé sur la réduction de l'ARN. La substitution avec des groupes plus grands a entraîné une activité cytoprotectrice plus faible (EC50 plus élevée dans le test basé sur la réduction de CPE), mais un effet similaire n'a pas été observé pour l'activité antivirale.

Dans ce travail, nous avons montré que dans des conditions non réductrices, les dérivés d'ebselen avec des substitutions et d'autres modifications dans le cycle phényle possèdent généralement de bonnes propriétés inhibitrices contre les protéases et la N7-guanine méthyltransférase codée par le nouveau coronavirus dans des essais in vitro. De plus, les dérivés de diséléniure d'ebselen possèdent une activité antivirale et cytoprotectrice élevée. Les résultats constituent une plate-forme prometteuse pour de nouvelles thérapies et nous pensons que les données peuvent être utilisées pour faciliter les efforts vers de nouveaux médicaments anticoronaviraux à utiliser pour le traitement du COVID-19.

Tous les solvants ont été distillés avant utilisation. Des réactifs disponibles dans le commerce ont été utilisés sans autre purification. La poudre de sélénium (100 mesh) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) utilisée pour la préparation de Na2Se2 et Li2Se2 avait une pureté ≥ 99,5 %. Le MeCN fraîchement distillé a été redistillé deux fois sur du P2O5 avant la préparation de l'ebselen et de ses dérivés. Le MeOH a été distillé lentement sur un mélange de LAH et de CaH2 avant l'hydrogénation de l'ebselen. CH2Cl2 (DCM) a été distillé sur P2O5 avant la préparation des analogues d'ebselen 25–34. La triéthylamine (Et3N) (POCh, Gliwice, Pologne), distillée sur NaOH, a été stockée sur des pastilles de NaOH. Le carbonate de sodium anhydre (Na2CO3) (POCh, Gliwice, Pologne) a été broyé dans un mortier avant utilisation. Les intermédiaires, le chlorure de 2-(chloroséléno)benzoyle et le diséléniure de bis[(2-chlorocarbony)phényl] ont été préparés à partir d'acide anthranilique et de sélénium élémentaire via la formation de diséléniure de 2,2′-dicarboxydiphényle, un intermédiaire clé, selon la procédure de la littérature60,61,63,64. La chromatographie préparative sur colonne a été réalisée sur du gel de silice Merck Si60 (63–200 µm). La CCM analytique a été réalisée sur des feuilles de PET pré-enduites de gel de silice (gel de silice Merck, 60 F254) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) et a été visualisée à la lumière (λmax = 254 nm) ou par coloration à la vapeur d'iode. Les points de fusion ont été déterminés sur un appareil de point de fusion numérique Electrothermal IA 91100 en utilisant la méthode capillaire ouverte standard. Les spectres IR (4000–400 cm-1) ont été enregistrés dans des plaques KBr sur un spectromètre FT-IR Perkin-Elmer 2000 ou sur un spectromètre Bruker VERTEX 70V à transformée de Fourier à l'aide d'un accessoire ATR en diamant. Les maxima d'absorption sont rapportés en nombres d'onde (cm-1). Les spectres 1H-RMN et 13C-RMN (300,1, 399,8, 600,6 MHz et 75,48, 100,5, 151,0 MHz, respectivement) ont été enregistrés sur un Bruker DRX 300 (Bruker, Rheinstetten, Allemagne), Jeol 400yh (Jeol, Tokyo, Japon) et Bruker Avance II 600 (Bruker, Pozna ń, Pologne) instruments. Les spectres RMN enregistrés dans CHCl3-d1 et DMSO-d6 ont été référencés aux signaux résiduels respectifs 1H ou 13C des solvants, et les déplacements chimiques (δ) sont donnés en parties par million (ppm), et les constantes de couplage (J) sont en Hz. 19F-NMR et 77Se-NMR (376,2 et 76,24 MHz, respectivement) ont été collectés sur l'instrument Jeol 400yh. Les spectres de masse à haute résolution ont été collectés par ionisation par électrospray sur un instrument Waters LCT Premier XE TOF.

La procédure de la littérature a été adaptée pour la préparation du diséléniure de dilithium62, des diséléniures de diaryle 2484, 2860,63, 3160, 32–3363, 3660,64, 3860 et du chlorure de 2-(chloroséléno)benzoyle (37)60. La pureté et l'homogénéité des composés connus ont été confirmées en mesurant leur mp pour ebselen60, 1–258, 357, 7–860, 985, 1186, 1660, 19–2263, 2360, 2487, 2687, 2863, 2987, 3160, 32–3363, 3686, 3788 et 3886, ou spectres FT-IR pour ebselen57, 357, 1066, 1186, 1660, 3160, spectres RMN 1H et/ou 13C pour 1–258, 759, 60, 863, 1086, 1186, 1660, 19–2263, 2360, 2484, 2863, 3160, 3263 et 77Se-NMR pour 1066 et HRMS pour 1660, et en les comparant avec les données de la littérature. Toutes les nouvelles espèces de sélénium 13, 30, 34, non caractérisées, 489, 587, 690, 985, 1291, 1491, 1592, 17–1893, 2592, 2792 et spectroscopiquement non caractérisées 26, 2987 ont été entièrement caractérisées. Les positions des atomes d'hydrogène et de carbone dans les spectres 1H-NMR et 13C-NMR ont été étayées par les expériences dept-135 ou COSY et par l'analyse cartographique 2D-NMR de la corrélation quantique multiple hétéronucléaire (HMQC) et la corrélation hétéronucléaire de liaisons multiples (HMBC), la spectroscopie d'amélioration Overhauser nucléaire (NOESY) si elle est mesurée. Voir les informations complémentaires pour les protocoles de synthèse détaillés et la caractérisation spectroscopique des composés.

SARS-CoV-2 PLpro a été préparé comme décrit26. En bref, pGEX6P-1-SARS-CoV-2PLpro a été transformé en cellules E. coli BL21 (DE3) codon-plus et induit avec 0,1 mM IPTG et 0,1 mM ZnSO4 à 18 ° C pendant la nuit. GST-fusion SARS-CoV-2 PLpro a été purifié à l'aide d'un protocole standard. La protéine de fusion a été clivée à l'aide de la protéase GST-PreScission à 4 ° C pendant une nuit, suivie d'un dessalage et d'un passage à travers des billes de glutathion fraîches pour éliminer la GST clivée et la protéase GST-PreScission. L'échantillon a été purifié davantage à l'aide de colonnes d'exclusion de taille (GE) Superdex de 200 pg équilibrées avec du Tris – Cl 20 mM pH 8, 0, du NaCl 40 mM et du DTT 2 mM. Les fractions de pic ont été regroupées et concentrées à ~ 10 mg/mL et congelées instantanément dans de l'azote liquide pour une utilisation ultérieure.

Le SARS-CoV-2 Mpro a été produit par recombinaison comme décrit18. En bref, le gène du Mpro a été cloné dans le vecteur PGEX-6p-1, qui a un Nsp4-Nsp5 et un site de clivage PreScission aux extrémités N et C, respectivement, pour générer la protéine cible authentique. Le gène de la protéine cible a été exprimé dans l'E. coli de la souche BL21-Gold (DE3) (Novagen). Le Mpro produit par recombinaison a été purifié en utilisant HisTrap FF (GE Healthcare) et la chromatographie échangeuse d'ions (Q FF, GE Healthcare). Enfin, la protéine cible de haute pureté a été soumise à un échange de tampon (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, pH 7,8) pour d'autres expériences.

La guanine N7-méthyltransférase nsp14 de la coiffe de l'ARNm du SARS-CoV-2 a été préparée comme décrit précédemment42. Brièvement, le gène nspl4 a été cloné dans le vecteur d'expression pET28 SUMO. Nsp14 a été surexprimé dans BL21 (DE3) RIL E. coli (Invitrogen), en tant que protéine de fusion avec SUMO marqué par His. La protéine de fusion a été purifiée à l'aide de la colonne HisTrap FFTM (Cytiva), suivie d'un chargement sur la colonne HiTrap 26/10 Desalting (Cytiva). Pour éliminer l'étiquette N-terminale (6 × His-Sumo), la protéase Sumo (MCLAB) a été ajoutée, puis la protéine nsp14 a été à nouveau purifiée sur une colonne HisTrap FFTM. Les fractions d'écoulement contenant nsp14 ont été collectées et séparées de l'étiquette N-terminale (6 × His-Sumo) et de la protéase Sumo marquée His. La fraction d'écoulement continu a ensuite été purifiée davantage sur une colonne de filtration sur gel Superdex 75 pg HiLoad 26/600 (Cytiva). Les fractions contenant nsp14 ont été concentrées à 30 μM, congelées et stockées à - 80 ° C dans un tampon contenant 50 mM HEPES (pH 8, 0), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 10% de glycérol.

L'évaluation de la bibliothèque de composés pour les inhibiteurs de SARS-CoV-2 PLpro et SARS-CoV-2 Mpro a été réalisée dans des plaques Corning à 96 puits. Pour PLpro, 1 µL de chaque composé dans une solution de DMSO a été ajouté aux puits. Ensuite, 79 µL d'enzyme préincubés pendant 10 min à 37 °C dans un tampon de dosage (Tris 50 mM, NaCl 5 mM, 0,075 % BSA, pH 7,5) ont été ajoutés à chaque puits. L'enzyme a été incubée avec les composés à 37°C pendant 30 min. Ensuite, 20 µL de substrat Ac-LRGG-ACC dans le tampon d'essai ont été ajoutés aux puits. Les concentrations finales étaient : 100 nM d'enzyme, 10 uM de substrat et 1 uM de composés testés. Dans le dosage de Mpro, 1 µL de chaque composé dans une solution de DMSO a été ajouté aux puits. Ensuite, 79 µL d'enzyme dans un tampon de test (Tris 50 mM, EDTA 1 mM, pH 7,3) 94 ont été ajoutés à chaque puits et la plaque a été incubée à température ambiante pendant 2 min. Ensuite, 20 µL de substrat QS1 dans le tampon d'essai ont été ajoutés aux puits. Les concentrations finales étaient : 100 nM d'enzyme, 50 uM de substrat et 100 nM ou 1 uM de composés testés. Les mesures ont été effectuées à 37 ° C à l'aide d'un spectrofluorimètre Molecular Devices Spectramax Gemini XPS. La libération de fluorophore ACC a été surveillée pendant 30 min (λex = 355 nm, λem = 460 nm). Pour l'analyse ultérieure, la plage linéaire des courbes de progression a été utilisée. Les mesures ont été effectuées au moins en double. Les résultats ont été présentés sous forme de valeurs moyennes d'inhibition enzymatique relative (%, par rapport à la mesure témoin sans inhibiteur) avec des écarts types. Au cours des essais, la concentration finale de DMSO dans les puits était < 2 %.

Pour déterminer la CI50, l'activité relative des protéases étudiées a été évaluée dans au moins 11 concentrations différentes d'inhibiteurs sélectionnés. Les concentrations initiales du composé ont été trouvées expérimentalement. Des dilutions en série d'inhibiteurs dans des tampons de test (décrits ci-dessus) ont été préparées dans des plaques à 96 puits (20 ul de chaque dilution dans des puits). Pour SARS-CoV-2 PLpro, 60 µL d'enzyme préincubés pendant 10 min à 37 °C dans du tampon de dosage ont été ajoutés aux puits. L'enzyme a été incubée avec des inhibiteurs pendant 30 min à 37°C. Ensuite, 20 µL de substrat (Ac-LRGG-ACC) dans du tampon de test ont été ajoutés aux puits. Les concentrations finales étaient de 100 nM d'enzyme et de 10 uM de substrat. Pour le SARS-CoV-2 Mpro, 60 µL d'enzyme ont été ajoutés sans préincubation. L'enzyme a été incubée avec l'inhibiteur pendant 2 min à température ambiante. Ensuite, 20 µL de substrat (QS1) dans le tampon de test ont été ajoutés aux puits. Les concentrations finales étaient de 100 nM pour l'enzyme et de 50 uM pour le substrat. Les mesures ont été effectuées à 37 ° C à l'aide d'un spectrofluorimètre Molecular Devices Spectramax Gemini XPS. La libération de fluorophore ACC a été surveillée pendant 30 min (λex = 355 nm, λem = 460 nm). Les valeurs IC50 ont été déterminées avec le logiciel GraphPad Prism à l'aide d'une régression non linéaire (dose-réponse - équation d'inhibition) et présentées sous forme d'activité enzymatique relative par rapport à la concentration d'inhibiteur. Les mesures ont été effectuées au moins en triple. Les résultats sont présentés sous forme de valeurs moyennes avec des écarts types. Au cours des essais, la concentration de DMSO dans les puits était < 2 %. Voir les informations supplémentaires pour les graphiques IC50.

Pour déterminer les paramètres IC50 des analogues d'ebselen vis-à-vis de l'enzyme nsp14, nous avons utilisé le test Py-FLINT décrit précédemment, conçu pour les études d'activité N7-MTase. La sonde Py-FLINT (1 µM) a été incubée avec le cosubstrat SAM (20 µM), nsp14 (40 nM) et un inhibiteur (dilutions demi-log logCinh < - 2,5 ; 2 >). Des mesures de fluorescence ponctuelle (λex = 345 nm, λem = 378 nm) ont été effectuées dans des plaques de dosage noires à 96 puits, non contraignantes, à 30 °C. Les taux initiaux V ont été calculés en ajustant une courbe linéaire aux 10 premiers points (10 min). Aux dépendances obtenues V(Cinh), l'équation dose-réponse à quatre paramètres suivante a été ajustée :

où A1 et A2 sont respectivement les asymptotes inférieure et supérieure ; Cinh la concentration en inhibiteur ; p est le coefficient de Hill, et V/V0 est le rapport de la vitesse de réaction initiale avec l'inhibiteur à celle sans l'inhibiteur. Pour l'ajustement des courbes et les calculs IC50, nous avons utilisé le logiciel GraphPad Prism.

L'activité anti-SARS-CoV-2 a été mesurée en déterminant dans quelle mesure les composés inhibaient l'effet cytopathique induit par le virus (CPE) et réduisaient l'ARN du SARS-CoV-2 dans les cellules Vero E6 (ECACC 85020206). Pour le test basé sur le CPE, des dilutions en série de deux fois des composés ont été ajoutées en triple exemplaire dans une plaque à 384 puits avec 5 000 cellules Vero E6 dans un milieu DMEM avec 2 % de FBS, 100 U de pénicilline/mL et 100 µg de streptomycine/mL (tous Merck). Après 1 h d'incubation, le SARS-CoV-2 (souche hCoV-19/Czech Republic/NRL_6632_2/2020 a été isolé dans un laboratoire de niveau de sécurité biologique 3 à partir d'un écouvillon nasopharyngé en inoculant des cellules Vero CCL81 [ECACC 84113001]) a été ajouté à une multiplicité d'infection de 0,05 UI/mL. Après trois jours d'incubation à 37 ° C dans 5% de CO2, la viabilité cellulaire a été déterminée par addition de solution XTT (Sigma-Aldrich) pendant 4 h et l'absorbance a été mesurée à l'aide d'un lecteur de plaques EnVision (Perkin Elmer). Les concentrations de médicament nécessaires pour réduire l'effet cytopathique viral de 50 % (EC50) ont été calculées à l'aide d'une régression non linéaire à partir de graphiques de pourcentage de viabilité cellulaire par rapport à la concentration de médicament log10 à l'aide du logiciel GraphPad Prism v.9.0.0. Pour le test basé sur la réduction de l'ARN, des dilutions en série de deux fois des composés ont été ajoutées en triple dans une plaque à 96 puits avec 20 000 cellules Vero étalées la veille dans le même milieu que ci-dessus. Après 1 h d'incubation, le SRAS-CoV-2 a été ajouté à une multiplicité d'infection de 0,05 UI/cellule. Après 2 h, le virus a été éliminé et un nouveau composé a été ajouté aux cellules. Les cellules ont été incubées pendant deux jours, puis le milieu a été utilisé comme matrice en RT-qPCR (Multiplex RT-PCR for COVID-19, Diana Biotechnologies, Czech Republic). Les concentrations de composés nécessaires pour réduire le nombre de copies d'ARN du SRAS-CoV-2 de 50 % (CE50) ont été calculées à partir de tracés du pourcentage du nombre de copies d'ARN par rapport à la concentration de médicament log10 comme ci-dessus.

La réduction maximale du titre pour les composés sélectionnés a été déterminée à la concentration EC90 qui a été calculée à partir des déterminations EC50 en utilisant l'équation EC90 = 9√H × EC50, où H est la pente de Hill. En bref, la concentration EC90 des composés sélectionnés a été ajoutée en triple exemplaire à 20 000 cellules Vero E6 ensemencées 24 h auparavant, incubées pendant 1 h et le SARS-CoV-2 à MOI = 0,05 UI/mL a été ajouté. Après 1 h d'incubation à 37 °C, le milieu à 5 % de CO2 a été retiré et des composés frais à EC90 ont été ajoutés et incubés pendant 48 h à 37 °C, 5 % de CO2. Le remdesivir a été inclus comme contrôle. La réduction du titre a été déterminée par essai sur plaque dans des cellules Vero E6. En bref, le surnageant de virus a été retiré, dilué en série dix fois dans une plaque à 24 puits, suivi de l'ajout de 300 000 cellules Vero E6 et d'une incubation de 4 h à 37 ° C, 5 % de CO2. Ensuite, la suspension a été recouverte de 1,5 % (p/v) de carboxyméthylcellulose dans du DMEM et incubée pendant 5 jours à 37 °C, 5 % de CO2. Après incubation, les cellules ont été lavées une fois avec 1 × PBS, colorées avec du noir de naphtalène pendant 45 min, lavées avec ddH2O et séchées à l'air. Les plaques ont été comptées et la différence entre l'absence de contrôle médicamenteux et le titre du virus composé a été exprimée en log10 d'unités formant plaque (PFU) par ml.

La cytotoxicité a été évaluée en incubant des dilutions en série de deux fois de chaque composé avec des cellules Vero E6. Après trois jours d'incubation à 37 °C dans 5 % de CO2, la viabilité cellulaire a été déterminée par addition d'une solution XTT comme ci-dessus. Les concentrations de composé entraînant une réduction de 50 % de l'absorbance (CC50) ont été calculées à partir de tracés du pourcentage d'absorbance par rapport à la concentration de médicament logio comme ci-dessus.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Acide α-aminobutyrique

7-Amino-4-carbamoylméthylcoumarine

Dichlorométhane

Diméthylformamide

Triéthylamine

Hexaméthylphosphoramide

Acétonitrile

Intensité de fluorescence à base de pyrène

S-adénosyl-l-méthionine

Tétrahydrofurane

tert-leucine

Wang, C. et al. Une nouvelle épidémie de coronavirus préoccupante pour la santé mondiale. Lancet 395(10223), 470–473 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, F. et al. Un nouveau coronavirus associé à une maladie respiratoire humaine en Chine. Nature 579(7798), 265–269 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Andersen, KG et al. L'origine proximale du SRAS-CoV-2. Nat. Méd. 26(4), 450–452 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dong, E., Du, H. & Gardner, L. Un tableau de bord Web interactif pour suivre le COVID-19 en temps réel. Lancette infectée. Dis. 20(5), 533–534 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Harvey, WT et al. Variantes du SRAS-CoV-2, mutations de pointe et évasion immunitaire. Nat. Rév. Microbiol. 19(7), 409–424 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heinz, FX & Stiasny, K. Caractéristiques distinctives des vaccins COVID-19 actuels : Connus et inconnus de la présentation de l'antigène et des modes d'action. Vaccins NPJ 6(1), 104 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zumla, A. et al. Coronaviruses—Découverte de médicaments et options thérapeutiques. Nat. Rev. Drug Discov. 15(5), 327–347 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Elfiky, AA Ribavirine, remdesivir, sofosbuvir, galidesivir et ténofovir contre l'ARN polymérase dépendante de l'ARN du SRAS-CoV-2 (RdRp) : une étude d'amarrage moléculaire. Vie Sci. 253, 117592 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jin, Z. et al. Structure du M(pro) du SARS-CoV-2 et découverte de ses inhibiteurs. Nature 582(7811), 289–293 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kandeel, M. & Al-Nazawi, M. Dépistage virtuel et réaffectation des médicaments approuvés par la FDA contre la protéase principale COVID-19. Vie Sci. 251, 117627 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Khodadadi, E. et al. Étude de combiner dépistage virtuel et traitements antiviraux du Sars-CoV-2 (Covid-19). Microb. Pathogène. 146, 104241 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rameshrad, M. et al. Un examen complet du repositionnement des médicaments contre la maladie à coronavirus 2019 (COVID19). Arc de Naunyn Schmiedebergs. Pharmacol. 393(7), 1137–1152 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Joshi, S., Joshi, M. & Degani, MS Lutte contre le SRAS-CoV-2 : Cibles proposées et médicaments réutilisés. Future Med. Chim. 12(17), 1579-1601 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Beigel, JH et al. Remdesivir pour le traitement du Covid-19—Rapport final. N. Engl. J. Med. 383(19), 1813–1826 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Consortium WHOST. Médicaments antiviraux réutilisés pour le Covid-19—Résultats provisoires de l'essai de solidarité de l'OMS. N. Engl. J. Med. 384(6), 497–511 (2021).

Article Google Scholar

Fehr, AR & Perlman, S. Coronaviruses : Un aperçu de leur réplication et pathogenèse. Méthodes Mol. Biol. 1282, 1–23 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hilgenfeld, R. Du SRAS au MERS : les études cristallographiques sur les protéases coronavirales permettent la conception de médicaments antiviraux. FEBS J. 281(18), 4085–4096 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, L. et al. La structure cristalline de la protéase principale du SRAS-CoV-2 fournit une base pour la conception d'inhibiteurs améliorés de l'alpha-cétoamide. Sciences 368 (6489), 409–412 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Anand, K. et al. Structure de la protéinase principale du coronavirus (3CLpro) : Base pour la conception de médicaments anti-SRAS. Sciences 300 (5626), 1763–1767 (2003).

Article CAS PubMed Google Scholar

Fan, K. et al. Biosynthèse, purification et spécificité de substrat de la protéinase de type 3C du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère. J. Biol. Chim. 279(3), 1637–1642 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Goyal, B. & Goyal, D. Cibler la dimérisation de la principale protéase des coronavirus : une stratégie thérapeutique potentielle à large spectre. ACS Combin. Sci. 22(6), 297–305 (2020).

Article CAS Google Scholar

Rut, W. et al. Inhibiteurs SARS-CoV-2 M(pro) et sondes basées sur l'activité pour l'imagerie d'échantillons de patients. Nat. Chim. Biol. 17(2), 222–228 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Yang, H. et al. Conception d'inhibiteurs à large spectre ciblant les protéases principales des coronavirus. PLoS Biol. 3(10), e324 (2005).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Freitas, BT et al. Caractérisation et inhibition non covalente de l'activité déubiquitinase et déISGylase de la protéase de type papaïne SARS-CoV-2. ACS Infect. Dis. 6(8), 2099-2109 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Klemm, T. et al. Mécanisme et inhibition de la protéase de type papaïne, PLpro, du SRAS-CoV-2. EMBO J. 39(18), e106275 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rut, W. et al. Profilage d'activité et structures cristallines de la protéase de type papaïne du SRAS-CoV-2 liée à l'inhibiteur : un cadre pour la conception de médicaments anti-COVID-19. Sci. Adv. 6(42), eabd4596 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shin, D. et al. La protéase de type papaïne régule la propagation virale du SRAS-CoV-2 et l'immunité innée. Nature 587(7835), 657–662 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lesser, R. & Weiß, R. Sur les composés aromatiques contenant du sélénium (VI). environ. German Chem. Ges. A/B 57, 1077-1082 (1924).

Article Google Scholar

Mugesh, G., du Mont, WW & Sies, H. Chimie des composés organosélénium synthétiques biologiquement importants. Chim. Rév. 101(7), 2125–2179 (2001).

Article CAS PubMed Google Scholar

Antony, S. & Bayse, CA Modélisation du mécanisme de la glutathion peroxydase mimique ebselen. Inorg. Chim. 50(23), 12075–12084 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Azad, GK & Tomar, RS Ebselen, un antioxydant prometteur : mécanismes d'action et cibles des voies biologiques. Mol. Biol. Rep. 41(8), 4865–4879 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sarma, BK & Mugesh, G. Activité antioxydante du composé anti-inflammatoire ebselen : une voie de cyclisation réversible via des intermédiaires d'acide sélénénique et séléninique. Chimie 14(34), 10603–10614 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bhabak, KP & Mugesh, G. Imitation fonctionnelle de la glutathion peroxydase : antioxydants synthétiques bioinspirés. Acc. Chim. Rés. 43(11), 1408-1419 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

Morgenstern, R., Cotgreave, IA & Engman, L. Détermination des contributions relatives des formes diséléniure et sélénol d'ebselen dans le mécanisme de son activité de type glutathion peroxydase. Chim. Biol. Interagir. 84(1), 77–84 (1992).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sands, KN ​​& Back, TG Étapes clés et intermédiaires du mécanisme catalytique de réduction des peroxydes par l'antioxydant ebselen. Tétraèdre 74(38), 4959–4967 (2018).

Article CAS Google Scholar

Sies, H. Ebselen, un composé séléno-organique comme mimétique de la glutathion peroxydase. Radic libre. Biol. Méd. 14(3), 313–323 (1993).

Article CAS PubMed Google Scholar

Mariage, JL et al. Enquête sur le devenir intracellulaire, la spéciation et le mode d'action des agents neuroprotecteurs contenant du sélénium à l'aide de XAS et XFM. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 1862(11), 2393–2404 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Weglarz-Tomczak, E. et al. Identification d'ebselen et de ses analogues en tant que puissants inhibiteurs covalents de la protéase de type papaïne du SRAS-CoV-2. Sci. Rep. 11(1), 3640 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Amporndanai, K. et al. Mécanisme d'inhibition de la protéase principale du SRAS-CoV-2 par l'ebselen et ses dérivés. Nat. Commun. 12(1), 3061 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cao, J., Forrest, JC et Zhang, X. Un écran de la bibliothèque de petites molécules de la NIH Clinical Collection identifie des médicaments anti-coronavirus potentiels. Antivirus. Rés. 114, 1–10 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Mangiavacchi, F. et al. La séléno-fonctionnalisation de la quercétine améliore l'inhibition non covalente de M(pro) et son activité antivirale dans les cellules contre le SARS-CoV-2. Int. J. Mol. Sci. 22(13), 7048 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kasprzyk, R. et al. Identification et évaluation d'agents antiviraux potentiels contre le SRAS-CoV-2 ciblant l'ARNm cap guanine N7-méthyltransférase. Antivirus. Rés. 193, 105142 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Chen, Y. et al. Le dépistage fonctionnel révèle la protéine non structurale nsp14 du coronavirus du SRAS en tant que nouvelle méthyltransférase cap N7. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 106(9), 3484–3489 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bouvet, M. et al. Reconstitution in vitro de la méthylation de la coiffe de l'ARNm du SRAS-coronavirus. PLoS Pathog. 6(4), e1000863 (2010).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Dong, H., Zhang, B. & Shi, PY Méthyltransférase de flavivirus : une nouvelle cible antivirale. Antivirus. Rés. 80(1), 1–10 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tong, TR Cibles médicamenteuses dans le virus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) et d'autres infections à coronavirus. Infecter. Désordre. Drug Targets 9(2), 223–245 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hartenian, E. et al. La virologie moléculaire des coronavirus. J. Biol. Chim. 295(37), 12910–12934 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Malone, B. et al. Structures et fonctions des complexes de réplication-transcription du coronavirus et leur pertinence pour la conception de médicaments contre le SRAS-CoV-2. Nat. Rév. Mol. Cell Biol. 23(1), 21–39 (2022).

Article MathSciNet CAS PubMed Google Scholar

Sancineto, L. et al. Conception et synthèse de DiselenoBisBenzamides (DISeBAs) en tant qu'inhibiteurs de la protéine nucléocapside 7 (NCp7) avec une activité anti-VIH. J. Med. Chim. 58(24), 9601–9614 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Thenin-Houssier, S. et al. Ebselen, une petite molécule inhibant la capside de la réplication du VIH-1. Antimicrobien. Agents Chemother. 60(4), 2195-2208 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sartori, G. et al. Action antivirale du diséléniure de diphényle sur l'infection par le virus de l'herpès simplex 2 chez les souris femelles BALB/c. J.Cell. Biochimie. 117(7), 1638-1648 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Mukherjee, S. et al. Ebselen inhibe la liaison de l'hélicase NS3 du virus de l'hépatite C à l'acide nucléique et empêche la réplication virale. ACS Chem. Biol. 9(10), 2393–2403 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Simanjuntak, Y. et al. Ebselen soulage la pathologie testiculaire chez les souris infectées par le virus Zika et prévient sa transmission sexuelle. PLoS Pathog. 14(2), e1006854 (2018).

Article MathSciNet PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, R. & Holmgren, A. Un nouveau mécanisme antioxydant de l'ebselen impliquant le diséléniure d'ebselen, un substrat de la thiorédoxine et de la thiorédoxine réductase de mammifères. J. Biol. Chim. 277(42), 39456–39462 (2002).

Article CAS PubMed Google Scholar

Azeredo, JB, Schwab, RS & Braga, AL Synthèse de molécules biologiquement actives contenant du sélénium à partir de perspectives plus vertes. Courant. Chimie Verte. 3(1), 51–67 (2016).

Article CAS Google Scholar

Balkrishna, SJ et al. Un catalyseur de type ebselen avec une activité GPx améliorée via un intermédiaire sélénol. Org. Biomol. Chim. 12(8), 1215-1219 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Balkrishna, SJ et al. Méthodologie de synthèse efficace catalysée au Cu pour l'ebselen et les hétérocycles Se-N apparentés. Org. Lett. 12(23), 5394–5397 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

Balkrishna, SJ, Bhakuni, BS et Kumar, S. Méthodologie de synthèse catalysée/médiée par le cuivre pour l'ebselen et les isoselenazolones apparentés. Tétraèdre 67(49), 9565–9575 (2011).

Article CAS Google Scholar

Osajda, M. & Młochowski, J. Les réactions du chlorure de 2-(chloroséléno)benzoyle avec des nucléophiles. Tétraèdre 58(37), 7531–7537 (2002).

Article CAS Google Scholar

Giurg, M. et al. Réaction du diséléniure de bis[(2-chlorocarbonyl)phényl] avec des phénols, des aminophénols et d'autres amines vers des diséléniures de diphényle aux propriétés antimicrobiennes et antivirales. Molécules 22(6), 974 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Mlochowski, J. et al. Synthèse et propriétés des 2-carboxyalkyl-1,2-benzisosélénazol-3(2H)-ones et des composés organosélénium apparentés en tant qu'inhibiteurs de l'oxyde nitrique synthase et inducteurs de cytokines. Liebig Ann. 1996(11), 1751–1755 (1996).

Article Google Scholar

Giurg, M. & Syper, L. Diséléniures de diaryle et composés apparentés comme agents de transfert d'oxygène. Phosphore Soufre Silicium Relat. Élém. 183(4), 970–985 (2008).

Article CAS Google Scholar

Piętka-Ottlik, M. et al. Synthèse de nouveaux analogues alkylés et méthoxylés de l'ebselen aux propriétés antivirales et antimicrobiennes. ARKIVOC 2017(2), 546–556 (2017).

Article Google Scholar

Weglarz-Tomczak, E. et al. Identification de la méthionine aminopeptidase 2 comme cible moléculaire du médicament organosélénié ebselen et de ses dérivés/analogues : synthèse, activité inhibitrice et étude de modélisation moléculaire. Bioorg. Méd. Chim. Lett. 26(21), 5254–5259 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bernatowicz, P. et al. Une étude RMN 13C, 15N et 77Se de certaines séléno et diséléno azines et composés apparentés. Pol. J. Chem. 71, 441–445 (1997).

CAS Google Scholar

Pacuła, AJ, Ścianowski, J. & Aleksandrzak, KB Synthèse hautement efficace et capacité antioxydante des benzisosélénazol-3(2H)-ones N-substitués. RSC Adv. 4(90), 48959–48962 (2014).

Article Google Scholar

Kasprzyk, R. et al. Test de criblage direct à haut débit pour l'activité de la guanine-N7 méthyltransférase de la coiffe de l'ARNm. Chimie 26(49), 11266–11275 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Delgado-Roche, L. & Mesta, F. Le stress oxydatif en tant qu'acteur clé de l'infection par le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV). Cambre. Méd. Rés. 51(5), 384–387 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Takayama, K. Modèles in vitro et animaux pour la recherche sur le SRAS-CoV-2. Tendances Pharmacol. Sci. 41(8), 513–517 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Menendez, CA et al. Caractérisation moléculaire de l'activité de liaison de l'ebselen à la protéase principale du SRAS-CoV-2. Sci. Adv. 6(37), eabd0345 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qiao, Z. et al. Les modifications basées sur la structure Mpro des dérivés d'ebselen pour une activité antivirale améliorée contre le virus SARS-CoV-2. Bioorg. Chim. 117, 105455 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ma, C. et al. L'ebselen, le disulfiram, le carmofur, le PX-12, le tideglusib et la shikonine sont les principaux inhibiteurs non spécifiques de la protéase SARS-CoV-2. ACS Pharmacol. Trad. Sci. 3(6), 1265-1277 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ma, C. et al. Validation et invalidation des principaux inhibiteurs de la protéase du SRAS-CoV-2 à l'aide des tests Flip-GFP et Protease-Glo luciférase. Acta Pharma. Péché. B 12(4), 1636–1651 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tan, H., Ma, C. & Wang, J. Invalidation du dieckol et du 1,2,3,4,6-pentagalloylglucose (PGG) en tant qu'inhibiteurs principaux de la protéase du SRAS-CoV-2 et découverte du PGG en tant qu'inhibiteur de la protéase de type papaïne. Méd. Chim. Rés. 31(7), 1147–1153 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heilmann, E. et al. Un test basé sur le VSV quantifie l'activité de la protéase principale du coronavirus Mpro/3CLpro/Nsp5 et l'inhibition chimique. Commun. Biol. 5(1), 391 (2022).

Article MathSciNet CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nogueira, CW, Barbosa, NV & Rocha, JBT Toxicologie et pharmacologie des composés organosélénium synthétiques : une mise à jour. Cambre. Toxicol. 95(4), 1179-1226 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Suhail, S. et al. Rôle du stress oxydatif sur l'infection par le SRAS-CoV (SRAS) et le SRAS-CoV-2 (COVID-19) : une revue. Protéine J. 39(6), 644–656 (2020).

Article MathSciNet PubMed PubMed Central Google Scholar

Taylor, EW & Radding, W. Comprendre le sélénium et le glutathion en tant que facteurs antiviraux dans COVID-19 : la protéase virale M (pro) cible-t-elle les sélénoprotéines hôtes et la synthèse du glutathion ?. Devant. Nutr. 7, 143 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Du, L. et al. Le stress oxydatif transforme 3CLpro en une forme insoluble et plus active pour favoriser la réplication du SRAS-CoV-2. Rédox. Biol. 48, 102199 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lynch, E. & Kil, J. Développement d'ebselen, un imitateur de glutathion peroxydase, pour la prévention et le traitement de la perte auditive induite par le bruit. Sémin. Entendre. 30(01), 047–055 (2009).

Article Google Scholar

Sharpley, AL et al. Un essai clinique de phase 2a randomisé, en double aveugle, contrôlé par placebo, en groupes parallèles, sur ebselen (SPI-1005) en tant que nouveau traitement de la manie ou de l'hypomanie. Psychopharmacologie 237(12), 3773–3782 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yamaguchi, T. et al. Ebselen dans l'AVC ischémique aigu : un essai clinique en double aveugle contrôlé par placebo. Groupe d'étude Ebselen. AVC 29(1), 12–17 (1998).

Article CAS PubMed Google Scholar

Singh, N. et al. Un mimétique du lithium sûr pour le trouble bipolaire. Nat. Commun. 4, 1332 (2013).

Article PubMed Google Scholar

Granda, J. et al. Synthèse de 2-aminophénoxazinones 7- et 8-fonctionnalisées par cyclocondensation de 2-aminophénols. Synthèse 47(21), 3321–3332 (2015).

Article CAS Google Scholar

Welter, A., Christiaens, L. & Wirtz-Peitz, F. Benzisosélénazolones et procédés pour le traitement des maladies rhumatismales et arthritiques les utilisant (1983).

Młochowski, J. et al. Diséléniures aromatiques et azaaromatiques, benzisosélénazolones et composés apparentés en tant qu'immunomodulateurs actifs chez l'homme : synthèse et propriétés. Liebig Ann. Chim. 1993(12), 1239–1244 (1993).

Article Google Scholar

Welter, A. et al. Amides d'acide disélénobis-benzoïque d'amines primaires et secondaires et procédés pour le traitement de maladies chez l'homme causées par une lésion cellulaire (1989).

Kuppers, J. et al. Synthèse convergente de deux hétérodimères fluorescents ebselen-coumarine. Pharmaceuticals (Bâle) 9(3), 43 (2016).

Article PubMed Google Scholar

Chang, TC et al. Synthèse et évaluation biologique de l'ebselen et de ses dérivés acycliques. Chim. Pharm. Taureau. (Tokyo) 51(12), 1413–1416 (2003).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gustafsson, TN et al. Ebselen et analogues comme inhibiteurs de la thiorédoxine réductase de Bacillus anthracis et antibactériens bactéricides ciblant les espèces de Bacillus, Staphylococcus aureus et Mycobacterium tuberculosis. Biochim. Biophys. Acta 1860(6), 1265-1271 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wan, J. et al. Composé benzosélénazole cétone et application de celui-ci et bactéricide (2021).

Bender, CO et al. Utilisation de petites molécules pour le traitement de la toxicité de Clostridium difficile (2015).

Garland, M. et al. Les modificateurs covalents de la neurotoxine botulique neutralisent la persistance de la toxine. ACS Chem. Biol. 14(1), 76–87 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xue, X. et al. Production de SARS-CoV M(pro) authentique avec une activité améliorée : application en tant que nouvelle endopeptidase de clivage par étiquette pour la surproduction de protéines. J. Mol. Biol. 366(3), 965–975 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

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Ce travail a été soutenu par l'Agence de recherche médicale en Pologne via son propre projet (subvention 2020/ABM/SARS/1) et par le numéro de subvention du Centre national des sciences de Pologne (2020/01/0/NZ1/00063) à MD et (UMO-2020/01/0/ST4/00124) à JJ Le laboratoire Drag est soutenu par le projet "TEAM/2017-4/32", qui est mené au sein de l'équipe programme de la Fondation pour la science polonaise cofinancé par l'Union européenne dans le cadre du Fonds européen de développement régional. Les travaux dans le laboratoire de Hilgenfeld ont été soutenus par le projet SCORE de l'Union européenne (accord de subvention # 101003627), par le Centre allemand de recherche sur les infections (DZIF) et par le gouvernement du Schleswig-Holstein par le biais de son Fonds de structure et d'excellence, ainsi que par un partenariat étroit entre la Fondation Possehl (Lübeck) et l'Université de Lübeck. La détermination de l'activité anti-SARS-CoV-2 a été soutenue par le projet FEDER/ESF ChemBioDrug CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000729 et l'Institut de chimie organique et de biochimie du CAS (RVO 61388963). Le laboratoire Olsen est soutenu par CPRIT RR200030 et NIH R01 GM115568 et GM128731. Nous sommes reconnaissants à l'Université des sciences et technologies de Wroclaw pour son soutien au Département de chimie organique et médicinale - K20 (Statut Funds 82013902).

Département de biologie chimique et de bioimagerie, Université des sciences et technologies de Wroclaw, Wyb. Wyspianskiego 27, 50-370, Wroclaw, Pologne

Mikolaj Zmudzinski, Wioletta Rut & Marcin Drag

Département de chimie organique et médicinale, Faculté de chimie, Université des sciences et technologies de Wroclaw, Wyb. Wyspianskiego 27, 50-370, Wroclaw, Pologne

Kamila Olech, Jaroslaw Granda, Miroslaw Giurg, Małgorzata Burda-Grabowska & Rafał Kaleta

Institut de chimie organique et de biochimie, Académie tchèque des sciences, Flemingovo Nám. 2, 16610, Prague, République tchèque

Michala Zgarbova et Jan Weber

Centre des nouvelles technologies, Université de Varsovie, Banacha 2C, 02-097, Varsovie, Pologne

Renata Kasprzyk et Jacek Jemielity

Collège d'études individuelles interfacultaires en mathématiques et sciences naturelles, Université de Varsovie, Banacha 2C, 02-097, Varsovie, Pologne

Renata Kasprzyk

Institut de médecine moléculaire, Université de Lübeck, Ratzeburger Allee 160, 23562, Lübeck, Allemagne

Linlin Zhang, Xinyuanyuan Sun et Rolf Hilgenfeld

Département de biochimie et de biologie structurale, University of Texas Health Science Center at San Antonio, San Antonio, TX, 78229, États-Unis

Zongyang Lv, Digant Nayak et Shaun K. Olsen

Institut national des médicaments, Ul. Chełmska 30/34, 00-725, Varsovie, Pologne

Malgorzata Kesik-Brodacka

Centre allemand de recherche sur les infections (DZIF), Site Hamburg-Lübeck-Borstel-Riems, Université de Lübeck, 23562, Lübeck, Allemagne

Rolf Hilgenfeld

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MZ et MD ont conçu la recherche ; MZ, WR et M.Zg. effectué la recherche et collecté les données ; KO, JG, MG et MB-G. synthétisé et fourni la collection de composés, MK-B., LZ, XS et RH ont fourni l'enzyme SARS-CoV-2 Mpro ; ZL, DN et SKO ont fourni l'enzyme SARS-CoV-2 PLpro, MZ, WR et JW ont analysé et interprété les données inhibitrices et MZ a rédigé le manuscrit ; tous les auteurs ont révisé le manuscrit de manière critique.

Correspondance à Mikolaj Zmudzinski ou Marcin Drag.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Zmudzinski, M., Rut, W., Olech, K. et al. Les dérivés d'Ebselen inhibent la réplication du SRAS-CoV-2 en inhibant ses protéines essentielles : les protéases PLpro et Mpro et la guanine N7-méthyltransférase nsp14. Sci Rep 13, 9161 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35907-w

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Reçu : 11 avril 2022

Accepté : 25 mai 2023

Publié: 06 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-35907-w

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