Angström

Nature volume 617, pages 711–716 (2023)Citer cet article

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La microscopie à fluorescence, avec sa spécificité moléculaire, est l'une des principales méthodes de caractérisation utilisées dans les sciences de la vie pour comprendre les systèmes biologiques complexes. Les approches de super-résolution1,2,3,4,5,6 peuvent atteindre une résolution dans les cellules de l'ordre de 15 à 20 nm, mais les interactions entre les biomolécules individuelles se produisent à des échelles de longueur inférieures à 10 nm et la caractérisation de la structure intramoléculaire nécessite une résolution d'Ångström. Les implémentations de super-résolution de pointe7,8,9,10,11,12,13,14 ont démontré des résolutions spatiales jusqu'à 5 nm et des précisions de localisation de 1 nm dans certaines conditions in vitro. Cependant, de telles résolutions ne se traduisent pas directement par des expériences dans des cellules, et la résolution d'Ångström n'a pas été démontrée à ce jour. Ici, nous introduisons une méthode de codage à barres ADN, l'amélioration de la résolution par imagerie séquentielle (RESI), qui améliore la résolution de la microscopie à fluorescence jusqu'à l'échelle Ångström en utilisant du matériel et des réactifs de microscopie à fluorescence prêts à l'emploi. En imageant séquentiellement des sous-ensembles cibles clairsemés à des résolutions spatiales modérées de> 15 nm, nous démontrons que la résolution d'une seule protéine peut être obtenue pour les biomolécules dans des cellules entières intactes. De plus, nous résolvons expérimentalement la distance du squelette d'ADN de bases simples dans l'origami d'ADN avec une résolution d'Ångström. Nous utilisons notre méthode dans une démonstration de preuve de principe pour cartographier l'arrangement moléculaire de la cible d'immunothérapie CD20 in situ dans des cellules non traitées et traitées avec des médicaments, ce qui ouvre des possibilités pour évaluer les mécanismes moléculaires de l'immunothérapie ciblée. Ces observations démontrent qu'en permettant l'imagerie intramoléculaire dans des conditions ambiantes dans des cellules entières intactes, RESI comble l'écart entre la microscopie à super-résolution et les études de biologie structurale et fournit ainsi des informations essentielles à la compréhension de systèmes biologiques complexes.

La précision de localisation (σSMLM) d'une molécule cible dans la microscopie de localisation d'une seule molécule à champ large (SMLM)15 est finalement et fondamentalement limitée par le nombre de photons (N) collectés par événement de clignotement : \({\sigma }_{{\rm {SMLM}}}\approx \frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{N}}\) (σDIFF est l'écart-type de la fonction d'étalement ponctuel (PSF) de l'optique système d'imagerie16 ; Fig. 1a). Plusieurs localisations de la même cible (Fig. 1b, en haut) sont réparties autour de la position réelle en raison de leur précision finie. Deux ou plusieurs points non résolubles par SMLM produisent des distributions de localisations qui se chevauchent, empêchant ainsi l'attribution unique de localisations aux cibles respectives (Fig. 1b, en bas). Cependant, si chaque localisation pouvait être attribuée à une cible spécifique par couleur, code-barres ou toute autre identité moléculaire, elles pourraient être regroupées sans ambiguïté par cible2.

a, Dans SMLM, σSMLM d'un seul colorant évolue avec \(\frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{N}}\), limitant finalement la résolution spatiale réalisable. b, les approches SMLM telles que DNA-PAINT présentent une résolution spatiale d'environ 10 nm (résolution approximative en pleine largeur à mi-hauteur ≈ 2, 35 σSMLM). Alors que les cibles séparées de 20 nm (d1) peuvent ainsi être résolues en routine, les objets espacés de 2 nm (d2) sont insolubles car les distributions résultantes des localisations se chevauchent. c, en utilisant des séquences d'ADN orthogonales (bleu et vert) et une acquisition séquentielle comme dans Exchange-PAINT, les localisations de cibles espacées plus étroitement que la limite de résolution SMLM peuvent être attribuées sans ambiguïté pour chaque cible. d, La combinaison de toutes les localisations par cible (K) pour chaque cycle d'imagerie améliore la précision de localisation de sd (σSMLM) à sem (σRESI). e, Comme la super-résolution a révolutionné la microscopie à fluorescence, RESI entraîne un autre changement de paradigme en réappliquant le concept de localisation aux données de super-résolution. f, Précision de localisation dans les échelles RESI avec \(\frac{1}{\sqrt{K}}\), et donc l'amélioration de la résolution dans RESI est indépendante de σSMLM, atteignant la précision de localisation sur l'échelle d'Ångström.

Le centre de chaque groupe de localisations peut être calculé avec une précision bien meilleure que σSMLM. Essentiellement, en appliquant le principe de la microscopie de localisation à des groupes distinguables de K localisations super-résolues, la précision est augmentée du sd (σSMLM) au sem (\(\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM}} }}{\sqrt{K}}\)). La collecte d'un nombre arbitrairement grand de localisations donne une augmentation arbitraire de la précision. Notamment, cette augmentation de la précision se produit quelle que soit la précision obtenue dans les localisations individuelles (σSMLM).

Nous introduisons une mise en œuvre simple de ce concept en utilisant Exchange-PAINT17, une variante de DNA-PAINT18, pour des molécules cibles identiques (Fig. 1c). DNA-PAINT utilise la liaison programmable, répétitive mais transitoire de brins « imageurs » marqués par un colorant à leurs brins complémentaires « d'amarrage » sur des molécules cibles d'intérêt9,18. La nature transitoire de la liaison conduit à un «clignotement» apparent de la cible, nécessaire pour effectuer SMLM. Exchange-PAINT utilise des codes-barres ADN orthogonaux combinés à des cycles d'imagerie et de lavage pour permettre un multiplexage cible séquentiel. Dans notre implémentation, nous "multiplexons" une seule espèce cible en la séparant en plusieurs sous-ensembles plus clairsemés. En les imageant séquentiellement, des groupes de localisations suffisamment espacés et isolés sont mesurés. La détermination du centre de chaque groupe de localisations donne une amélioration de la résolution (Fig. 1d). Nous appelons cette implémentation amélioration de la résolution par imagerie séquentielle (RESI), et les localisations résultantes localisations RESI.

En appliquant RESI in silico (Méthodes), nous avons démontré une amélioration de la résolution (Extended Data Fig. 1) par rapport à la super-résolution semblable à l'amélioration des mesures super-résolues par rapport aux mesures limitées par la diffraction (Fig. 1e). Pour une précision de localisation DNA-PAINT pouvant être obtenue en routine (environ 3 nm) et un nombre de localisations par cible (de l'ordre de centaines), RESI pourrait atteindre une précision bien inférieure à un nanomètre, entrant ainsi dans l'échelle Ångström (Fig. 1f) selon \( {\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM}}}}{\sqrt{K}}\).

Pour une preuve de principe expérimentale de RESI, nous avons utilisé des structures d'origami d'ADN auto-assemblées pour positionner précisément des brins d'ADN orthogonaux9,19. Nous avons d'abord conçu l'origami d'ADN comportant deux brins d'amarrage espacés de 5 nm, une distance précédemment résolue avec DNA-PAINT7,9, pour vérifier l'exactitude et la précision de RESI. En utilisant deux séries d'imagerie séquentielles et une procédure d'alignement (Méthodes) pour effectuer RESI, nous avons pu récapituler avec précision la distance point à point de 5 nm avec une précision améliorée d'un facteur de \(\sqrt{{K}_{{\ rm{average}}}}=\sqrt{381}\approx 20\) (Données étendues Figs. 2 et 3).

Nous avons ensuite effectué RESI en trois dimensions (3D) en utilisant des structures de disques d'origami d'ADN 3D récemment développées et mesuré des distances entre les brins d'amarrage de 2, 5 ± 0, 4 nm en xy et de 11, 3 ± 0, 8 nm en z. Cela démontre que l'amélioration de la résolution RESI s'applique dans les trois dimensions, dépassant les capacités de super-résolution 3D de pointe actuelles (Données étendues Figs. 4 et 5 ; pour les paramètres d'imagerie, voir le tableau de données étendu 1).

Pour démontrer l'applicabilité de RESI dans un contexte cellulaire, nous avons ensuite imagé les protéines structurelles du complexe de pores nucléaires (NPC). En tant que principal gardien du transport nucléocytoplasmique, le NPC est une cible clé pour la recherche en biologie structurale21. Nous avons en outre choisi le NPC comme système modèle car il a été bien étudié à l'aide d'une variété d'approches d'imagerie, y compris la cryo-microscopie électronique (cryo-EM)22, la microscopie à fluorescence et les techniques de super-résolution23,24. La figure 2a présente une image typique à diffraction limitée et ADN-PAINT de molécules Nup96 (marquées avec une protéine fluorescente verte améliorée monomérique (mEGFP)) marquées avec des nanocorps anti-GFP conjugués à l'ADN. Nup96 est une protéine NPC structurelle (partie du soi-disant complexe Y) présente en huit paires présentant une symétrie octuple sur les anneaux cytoplasmiques et nucléaires, totalisant 32 copies par NPC (Fig. 2b). Les paires individuelles de protéines Nup96, espacées d'environ 10 nm latéralement et 3 nm axialement, ne peuvent pas être résolues de manière routinière avec les implémentations de super-résolution de pointe actuelles25,26,27,28. Pour activer RESI, les copies voisines des protéines Nup96 doivent être marquées avec des séquences d'ADN orthogonales. À cette fin, nous avons opté pour une approche de marquage stochastique en incubant l'échantillon avec des nanobodies anti-GFP, chacun conjugué à une séquence orthogonale sur quatre (Fig. 2c). Nous notons qu'avec un nombre croissant de cibles attendues en dessous de la limite de résolution classique de l'ADN-PAINT, un plus grand nombre de séquences de marquage orthogonales29 - et donc de cycles d'imagerie - est nécessaire pour garantir des groupes de localisations suffisamment espacés (pour plus de détails sur cette exigence, voir Méthodes ). L'acquisition séquentielle d'images 3D en quatre tours a conduit à des groupes de localisation suffisamment espacés représentant des molécules cibles Nup96 uniques (Fig. 2d). La super-localisation RESI ultérieure de ces groupes nous a permis de visualiser en routine des copies individuelles des protéines Nup96 (Fig. 2e). Nous notons que cela a été réalisé sur l'ensemble du champ de vision (environ 67 × 67 µm2) totalisant plus de 1 000 PNJ pendant une durée totale d'acquisition d'image de 100 min (voir Extended Data Fig. 6 pour des données représentatives). L'image RESI reconstruite présente une précision de localisation latérale moyenne d'environ 1 nm, ce qui représente une amélioration de six fois par rapport aux cycles d'acquisition DNA-PAINT individuels. Nous avons donc obtenu une résolution limitée par la taille de l'étiquette, ce qui nous a permis de résoudre des molécules Nup96 individuelles (Fig. 2f). En règle générale, la taille de l'étiquette limite non seulement la résolution spatiale, mais peut en outre entraîner des inexactitudes telles que des distances observées biaisées en raison d'erreurs de liaison.

a, Image d'ensemble limitée par la diffraction et DNA-PAINT de Nup96-mEGFP marqué avec des nanocorps anti-GFP conjugués à l'ADN. La vue agrandie (en bas à droite) montre une efficacité d'étiquetage et une qualité d'image élevées pour les conditions standard d'ADN-PAINT, récapitulant la symétrie octuple du PNJ. b, représentation de la structure Cryo-EM de l'emplacement des protéines Nup96 (rouge ; position mEGFP C-terminale marquée en bleu) dans le cadre du complexe Y dans les anneaux nucléaires et cytoplasmiques (NR et CR, respectivement). Adapté de l'APB 7PEQ. Nup96 est présent en 32 exemplaires par PNJ. c, Pour activer RESI, les protéines Nup96-mEGFP ont été marquées de manière stochastique avec des séquences d'ADN orthogonales par incubation de l'échantillon avec des nanocorps anti-GFP, chacun conjugué à l'une des quatre séquences orthogonales (représentées par des points bleus, jaunes, magenta et verts). d, l'imagerie 3D séquentielle (la couleur représente la position z) des quatre étiquettes a donné des distributions de localisation suffisamment espacées. Le nombre moyen de localisations par cible est Kaverage = 38 (l'arrière-plan représente la structure cryo-EM de b pour le contexte). e, Comparaison de 3D DNA-PAINT (en haut à gauche) et 3D RESI (en bas à droite) pour le même NPC illustrant l'amélioration de la résolution spatiale par RESI. Les localisations sont rendues sous forme de gaussiennes avec σDNA-PAINT et σRESI, respectivement. f, une précision de localisation (σRESI) aussi bonne que 5 Å a été obtenue en combinant les localisations K pour chaque cible, en résolvant sans ambiguïté les protéines Nup96 uniques. g, La structure cryo-EM 3D des PNJ a été récapitulée à l'aide de la microscopie optique en appliquant une moyenne sans modèle30 de 1 217 PNJ à partir d'un seul noyau. h, RESI a résolu Nup96 adjacent dans une moyenne structurelle par microscopie optique. i, Conformément à la structure cryo-EM (en tenant compte de l'erreur de liaison résultant de la taille de l'étiquette), les protéines Nup96 adjacentes étaient espacées de 11, 9 ± 1, 2 nm latéralement (en haut) et de 5, 4 ± 0, 4 nm axialement (en bas).

Nous avons ensuite effectué une moyenne 3D impartiale de 1 217 PNJ en utilisant une approche sans modèle récemment développée pour les données SMLM30. La moyenne 3D résultante (Fig. 2g) permet non seulement de récapituler la symétrie octuple de Nup96 dans les anneaux cytoplasmiques et nucléaires (ce qui a déjà été réalisé avec une super-résolution23,24,25,26,27,28), mais permet la résolution des protéines Nup96 individuelles dans une moyenne structurelle (Fig. 2h). Grâce à la résolution spatiale sans précédent de RESI, nous avons pu récapituler les distances des protéines Nup96 de 11,9 ± 1,2 nm latéralement et de 5,4 ± 0,4 nm axialement à partir de l'image structurelle moyenne (Fig. 2i). L'orientation latérale et axiale, ainsi que l'inclinaison, des paires Nup96 sont compatibles avec les données cryo-EM22. Nous avons résolu cet arrangement spatial pour la plupart des paires de protéines Nup96 (Extended Data Fig. 7), qui était auparavant hors de portée de la microscopie optique.

Pour tester la résolution spatiale finalement réalisable par RESI, nous avons conçu une structure d'origami d'ADN plate et rectangulaire comportant six paires (espacées de 20 nm) de brins d'amarrage orthogonaux directement adjacents à une distance d'une seule paire de bases d'ADN (brins rouges et bleus sur la Fig. .3a). Cela a donné une distance dans le plan conçue d'environ 7 Å le long du squelette d'un brin de la double hélice d'ADN31. Les structures contiennent également des brins d'amarrage DNA-PAINT pour un alignement précis entre les cycles d'imagerie séquentiels (brins verts sur la figure 3a). L'acquisition d'images DNA-PAINT à la pointe de la technologie32 à une résolution spatiale d'environ 5 nm a produit six nuages ​​​​de localisation dans une disposition de grille de 20 nm, mais n'a pas réussi à résoudre les brins d'amarrage individuels à des distances inférieures au nanomètre d'une paire de bases (Fig. 3b).

a, l'origami d'ADN avec des brins d'amarrage espacés par une seule paire de bases (pb ; brins rouges et bleus, avec des marqueurs d'alignement en vert) a fourni une plate-forme pour démontrer la résolution la plus élevée réalisable par RESI. b, DNA-PAINT a résolu un espacement de 20 nm mais la résolution était insuffisante pour distinguer les sites d'amarrage individuels, espacés d'une base. c, RESI résout les brins d'amarrage adjacents. d, Une distance euclidienne de 8,5 ± 1,7 Å a été calculée à partir de localisations individuelles avec une précision moyenne de 1,2 Å (à gauche) pour la distance dorsale à paire de bases unique, qui est à moins de 1 sd de la valeur attendue d'environ 7 Å (à droite ). e, La précision de localisation expérimentale dans RESI est en bon accord avec \(\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM}}}}{\sqrt{K}}\) (ligne bleue, K), donnant un précision de localisation moyenne de 1,3 Å pour les données expérimentales de tous les n = 42 origamis ADN (les encarts correspondent à un exemple de paire de points en d). Les barres d'erreur représentent la moyenne ± 1 sd

Remarquablement, RESI résout les positions individuelles des brins d'amarrage (Fig. 3c) dans toutes les structures d'origami d'ADN. Nous notons que RESI y est parvenu en un temps d'acquisition d'image de 100 min avec un champ de vision d'environ 67 × 67 μm2 contenant plus de 2 000 structures d'origami d'ADN (voir Extended Data Fig. 8 pour les structures d'origami d'ADN représentatives). RESI nous permet de résoudre en routine des brins espacés d'une seule paire de bases d'ADN. De manière frappante, nous avons mesuré une distance de 8, 5 ± 1, 7 Å entre deux brins d'amarrage simples dans une structure d'origami d'ADN individuelle (Fig. 3d). Cela démontre une résolution sans précédent en microscopie optique en distinguant les structures à moins d'un nanomètre. Nous notons que notre revendication de résolution est basée sur la définition la plus fondamentale et la plus stricte : la capacité de distinguer spatialement des objets ponctuels. Nous avons mesuré une distance de 9,5 ± 2,6 Å entre les brins d'amarrage adjacents dans une moyenne de 42 origamis d'ADN (Extended Data Fig. 9), ce qui est à moins de 1 sd de la distance attendue du squelette31 d'environ 7 Å.

Pour quantifier le gain de résolution, nous avons calculé les localisations RESI pour différentes valeurs de K localisations ADN-PAINT sous-jacentes (Méthodes). Nous démontrons que la précision de localisation effective est égale à \({\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM}}}}{\sqrt{K} }\), donnant une précision de localisation moyenne de 1, 3 Å pour un K moyen = 254 (Fig. 3e), confirmant expérimentalement les résultats in silico (Fig. 1f). RESI produit non seulement un nombre pratiquement illimité de localisations par cible, mais évite également les effets photophysiques néfastes causés par la proximité spatiale des marqueurs à colorant fixe car, dans l'imagerie DNA-PAINT, deux colorants adjacents ne sont jamais présents simultanément. Il a récemment été rapporté33 qu'à des distances inférieures à 10 nm, les interactions photophysiques en champ proche jouent un rôle majeur dans la modulation de la cinétique de photocommutation, empêchant ainsi efficacement les techniques SMLM à colorant fixe d'accéder à cette échelle de résolution. Cela limite finalement la résolution réalisable même des techniques les plus efficaces en photons disponibles pour la localisation d'une seule molécule, telles que MINFLUX ou MINSTED, malgré leur précision subnanométrique, à moins qu'elles ne soient combinées avec DNA-PAINT. La résolution subnanométrique démontrée expérimentalement illustre la capacité du RESI à permettre des études de biologie structurale utilisant l'imagerie basée sur l'ADN à des échelles jusqu'ici insaisissables.

Enfin, nous avons appliqué RESI pour aborder et résoudre une question de biologie cellulaire actuellement en débat qui a jusqu'à présent été hors de portée à la fois pour la cryo-EM dans un contexte cellulaire natif et les techniques de super-résolution en place. Plus précisément, nous avons étudié l'organisation des récepteurs membranaires CD20, qui sont des cibles de choix pour le traitement thérapeutique par anticorps des cancers du sang dérivés des cellules B et des maladies auto-immunes34.

Dans le cas de l'anticorps anti-CD20 thérapeutique le plus fréquemment utilisé, le rituximab (RTX), le réarrangement spatial du CD20 dans la membrane cellulaire jouerait un rôle important dans son efficacité35,36. Des études cryo-EM récentes ont détecté le CD20 sous forme de dimère dans un complexe avec deux régions individuelles de liaison à l'antigène de fragment RTX37,38, suggérant un assemblage en chaîne linéaire de CD20 en présence de l'anticorps complet38. D'autre part, lorsqu'il est incubé avec l'anticorps RTX complet, un anneau trimérique de molécules RTX alternées et de dimères CD20 a été détecté dans les images EM37. Le fait que les expériences cryo-EM soient réalisées dans une solution détergente soulève la question de savoir quels arrangements moléculaires sont réellement présents dans la cellule. Actuellement, l'organisation de CD20 lorsqu'elle est liée à des anticorps RTX complets dans des cellules intactes ne peut pas être évaluée, ce qui empêche de déterminer si les grappes de CD20 sont de nature linéaire ou circulaire. De plus, même si des études in vitro ont montré que des dimères de CD20 peuvent se former sans liaison d'anticorps, l'évaluation quantitative de la dimérisation de CD20 dans des cellules non traitées est actuellement limitée.

Ici, nous avons appliqué RESI pour étudier l'arrangement moléculaire de CD20 dans des cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO) transfectées de manière transitoire avec mEGFP-CD20, en utilisant quatre cycles d'échange de sondes dans un temps d'imagerie total de 4,4 h. Dans la vue d'ensemble limitée par la diffraction et l'image super-résolution DNA-PAINT des cellules non traitées, le CD20 semblait distribué de manière homogène (Fig. 4a, b (en haut) et données étendues Fig. 10a) tandis que les cellules traitées par RTX présentaient des amas CD20 apparents (Fig. 4b (en bas) et Données étendues Figs. 11a et 12a).

a, Image d'ensemble limitée par la diffraction et DNA-PAINT de cellules CHO exprimant mEGFP-CD20 marquées avec des nanobodies anti-GFP. b, Image ADN-PAINT agrandie montrant des récepteurs CD20 apparemment distribués de manière aléatoire pour les cellules non traitées (en haut) et la disposition des récepteurs en cluster pour les cellules traitées au RTX (en bas). c, Comparaison de DNA-PAINT et RESI pour les cellules non traitées et traitées par RTX montrant des paires de récepteurs espacées de moins de 10 nm dans les images RESI, qui ne peuvent pas être résolues avec DNA-PAINT. d, les données RESI suggèrent que les protéines CD20 se produisent dans des dimères (espacés de ddimère), qui sont à leur tour distribués selon un caractère aléatoire spatial complet (CSR ; distances entre les dimères, dCSR) dans les cellules non traitées. Des chaînes de dimères ont été observées après administration de RTX. e, analyse de cellules entières des premiers NND des récepteurs CD20 (les histogrammes des distances et l'estimation de la densité du noyau sont présentés). Seul RESI, mais pas DNA-PAINT, permet la détection de routine de distances inférieures à 10 nm entre les protéines. Alors que DNA-PAINT surestime la distance des dimères, RESI montre une distance limitée par l'étiquette de 13,5 nm (voir le texte principal pour la discussion). f, l'ajustement des données RESI NND de e à un modèle numérique révèle des dimères et des monomères CD20. g, les récepteurs CD20 dans les cellules non traitées ont montré des deuxième à quatrième NND compatibles avec la RSE, excluant ainsi la présence de complexes protéiques d'ordre supérieur. h, les récepteurs CD20 dans les cellules traitées au RTX ont cependant montré des premier à quatrième NND, incompatibles avec un caractère aléatoire spatial complet.

La comparaison de DNA-PAINT et RESI pour les cellules non traitées et traitées par RTX montre des paires de CD20 espacées de moins de 10 nm dans les images RESI (Fig. 4c, à droite) qui ne pouvaient pas être résolues avec DNA-PAINT (Fig. 4c, à gauche) . Les images RESI suggèrent que CD20 est présent dans des dimères et des structures d'ordre supérieur en forme de chaîne dans des cellules non traitées et traitées par RTX, respectivement (Fig. 4d).

Pour évaluer quantitativement l'existence de dimères dans les cellules non traitées, nous avons effectué une analyse de la première distance du plus proche voisin (NND) pour les données DNA-PAINT et RESI, démontrant des distributions non aléatoires dans les deux cas (Fig. 4e). RESI à une précision de localisation de 1 nm montre une fraction substantielle de distances inférieures à 10 nm dans l'histogramme NND, ce qui permet une évaluation quantitative du degré de dimérisation du CD20. Nous avons effectué des simulations numériques et un ajustement des moindres carrés (Méthodes) qui ont donné une composition de 53 ± 1% de monomères et de 47 ± 1% de dimères avec une distance intradimère moyenne de 13, 5 ± 0, 3 nm (Fig. 4f, ligne continue). À titre de comparaison, nous avons simulé des distributions NND correspondant à une population de 100% de monomères (Fig. 4f, ligne pointillée), démontrant en outre que les molécules de CD20 ne sont pas présentes uniquement sous forme de monomères. Étant donné que toutes les distributions NND, à l'exception du premier ordre, sont cohérentes avec une distribution aléatoire spatiale complète (CSR) à la densité mesurée expérimentalement, nous excluons la présence d'assemblages d'ordre supérieur pour le CD20 non traité (Fig. 4g). Nos résultats présentent des preuves expérimentales quantitatives que CD20 existe sous forme de dimères dans une membrane cellulaire intacte.

En revanche, l'analyse RESI de CD20 dans les cellules traitées au RTX a donné des distributions de la première à la quatrième NND incompatibles avec un modèle CSR (Fig. 4h et données étendues Fig. 12d, e). Cela suggère un arrangement d'ordre supérieur des molécules CD20 après le traitement RTX et confirme les récents modèles dérivés de cryo-EM37,38.

Enfin, nous avons sondé l'existence d'arrangements hexamères en forme d'anneau par comparaison avec des simulations numériques (Extended Data Fig. 13). Les caractéristiques des amas de CD20 détectés expérimentalement suggèrent l'absence d'hexamères isolés et soutiennent l'hypothèse de structures principalement linéaires en forme de chaîne (Extended Data Fig. 13h).

Nous introduisons RESI, une approche conceptuellement nouvelle en SMLM pour améliorer la résolution spatiale de la microscopie optique à l'échelle d'Ångström. RESI y parvient en combinant plusieurs localisations à partir de cibles uniques pour obtenir une image «super-super-résolution» après avoir séparé leurs localisations par imagerie séquentielle (par exemple, à l'aide de sondes à code-barres ADN).

De cette manière, la précision RESI - et donc la résolution - évolue non seulement avec le nombre de photons (N) détectés par localisation, mais également avec le nombre de localisations (K) acquises par cible. RESI fournit ainsi une nouvelle loi d'échelle de précision : \({\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM}}}}{\sqrt{K} }\approx \frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{K}\sqrt{N}}\). Cela s'applique si un nombre suffisamment grand de séquences de marquage orthogonales et donc de cycles d'imagerie garantissent des groupes de localisations suffisamment espacés (Extended Data Fig. 14). Il est important de noter que l'amélioration de la résolution est isotrope en trois dimensions. Pour notre mise en œuvre expérimentale actuelle, RESI aborde la résolution de la biologie structurale avec une approche tout optique dans des cellules intactes à l'aide de réactifs d'étiquetage prêts à l'emploi et d'un simple microscope à fluorescence inversé fonctionnant dans des conditions ambiantes. Nous avons pu démontrer expérimentalement une résolution spatiale d'Ångström inférieure à la taille physique d'un colorant. Ceci a été réalisé grâce à trois avantages spécifiques de DNA-PAINT conduisant à un échantillonnage cible impartial: (1) la flexibilité de rotation du brin d'amarrage lié à la cible (même dans le cas de motifs de séquence répétitive plus longs32); (2) le dipôle en rotation libre du colorant attaché à la séquence d'imageur ; et (3) le fait que deux imageurs adjacents ne sont jamais présents simultanément.

De plus, comme les images RESI ne sont pas obtenues à partir de localisations uniques mais à partir de groupes de localisations par cible, la méthode présente une caractéristique robuste unique par rapport aux autres techniques SMLM : elle déplace l'accent de l'amélioration de la précision optique uniquement (σOPT) vers l'amélioration de la précision globale. (\({\sigma }_{{\rm{SMLM}}}\approx \sqrt{{{\sigma }_{{\rm{OPT}}}}^{2}+{{\sigma }_{ {\rm{MEC}}}}^{2}}\)) en calculant la moyenne des effets d'incertitude de l'instabilité mécanique (σMEC), à condition que cette dernière soit normalement distribuée.

Avec RESI, nous avons mesuré des zones de 67 × 67 μm2 en 100 min, ce qui en fait un outil suffisamment performant pour la biologie cellulaire. La résolution des modèles de récepteurs à la résolution d'une seule protéine pourrait permettre le «diagnostic spatial» comme méthode de présélection pour les traitements personnalisés et servir d'outil pour la découverte biomédicale de thérapies à motifs, par exemple en guidant les principes de conception de médicaments.

Les performances et la précision du RESI pourraient être encore améliorées par les progrès des approches de marquage intramoléculaire telles que les acides aminés non naturels orthogonaux39. RESI est ainsi sur le point de combler l'écart entre la microscopie à super-résolution de fluorescence 3D dans des cellules entières intactes et les études structurales cryo-EM de complexes supramoléculaires individuels, introduisant un changement de paradigme dans l'imagerie de fluorescence en poussant la microscopie optique vers des résolutions d'Ångström.

Les oligonucléotides d'ADN non modifiés, ainsi que les oligonucléotides d'ADN modifiés avec C3-azide et Cy3B, ont été achetés auprès de MWG Eurofins et Metabion. L'échafaudage M13mp18 et p7560 a été obtenu auprès de Tilibit. Chlorure de magnésium (1 M, n° AM9530G), chlorure de sodium (5 M, n° AM9759), eau ultrapure (n° 10977-035), Tris (1 M, pH 8,0, n° AM9855G), EDTA (0,5 M, pH 8,0, n° AM9260G) et du PBS 10X (n° 70011051) ont été achetés chez Thermo Fisher Scientific. Le BSA (n° A4503-10G) a été commandé auprès de Sigma-Aldrich. Le Triton X-100 (n° 6683.1) a été acheté auprès de Carl Roth. L'hydroxyde de sodium (n° 31627.290) a été acheté auprès de VWR. Le paraformaldéhyde (n° 15710) et le glutaraldéhyde (n° 16220) ont été obtenus auprès de Electron Microscopy Sciences. Tween-20 (n° P9416-50ML), glycérol (n° 65516-500 ml), méthanol (n° 32213-2.5L), protocatéchuate 3,4-dioxygénase pseudomonas (PCD, n° P8279), 3,4- l'acide dihydroxybenzoïque (PCA, n° 37580-25G-F) et l'acide (±)-6-hydroxy-2,5,7,8-tétra-méthylchromane-2-carboxylique (trolox, n° 238813-5G) ont été commandés chez Sigma-Aldrich. La neutravidine (n° 31000) a été achetée chez Thermo Fisher Scientific. La BSA marquée à la biotine (n° A8549) et l'azoture de sodium (n° 769320) ont été obtenues auprès de Sigma-Aldrich. Les lamelles (n° 0107032) et les lames de verre (n° 10756991) ont été achetées respectivement auprès de Marienfeld et Thermo Fisher Scientific. Sérum bovin fœtal (FBS, n° 10500-064), 1× PBS (pH 7,2, n° 20012-019), 0,05 % trypsine-EDTA (n° 25300-054), ADN de sperme de saumon (n° 15632011), OptiMEM (n° 31985062) et Lipofectamine LTX (n° A12621) ont été achetés auprès de Thermo Fisher Scientific. Des nanoparticules d'or (90 nm, n° G-90-100) ont été commandées chez Cytodiagnostics. Des nanocorps contre la GFP (clone 1H1) avec une seule cystéine ectopique à l'extrémité C-terminale pour la conjugaison spécifique au site ont été achetés auprès de Nanotag Biotechnologies. DBCO-PEG4-maléimide (n° CLK-A108P) a été acheté auprès de Jena Bioscience.

Les tampons suivants ont été utilisés pour la préparation des échantillons et l'imagerie.

Tampon A : 10 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl et 0,05 % Tween-20

Tampon B : 10 mM MgCl2, 5 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA et 0,05 % Tween-20 pH 8,0

Tampon C : 1× PBS, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl pH 7,4, 0,02 % Tween, éventuellement additionné de 1× trolox, 1× PCA et 1× PCD

Tampon de blocage : 1× PBS, 1 mM EDTA, 0,02 % Tween-20, 0,05 % NaN3, 2 % BSA, 0,05 mg ml–1 ADN de sperme de saumon cisaillé

Tampon de pliage d'origami d'ADN bidimensionnel (2D) : Tris 10 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 12,5 mM pH 8,0

Tampon de pliage d'origami d'ADN 3D : Tris 5 mM, EDTA 1 mM, NaCl 5 mM, MgCl2 20 mM pH 8,0

Tampon TA 1× : Tris 40 mM pH 8,0, acide acétique 20 mM

Le trolox (100x) a été préparé par addition de 100 mg de trolox à 430 ul de méthanol à 100 % et 345 ul de NaOH 1 M dans 3,2 ml d'eau. Le PCA (40x) a été fabriqué en mélangeant 154 mg de PCA dans 10 ml d'eau et de NaOH et en ajustant le pH à 9,0. Le PCD (100x) a été préparé par addition de 9,3 mg de PCD à 13,3 ml de tampon (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 50 % de glycérol).

Quatre motifs de séquence d'ADN orthogonaux ont été utilisés pour marquer les cibles dans quatre cycles RESI. Les brins d'amarrage étaient 5xR1 (TCCTCCTCCTCCTCCCTCCT), 5xR2 (ACCACCACCACCACCACCA), 7xR3 (CTCTCTCTCTCTCTCTCTC) et 7xR4 (ACACACACACACACACACA). Les imageurs respectifs étaient R1 (AGGAGGA-Cy3B), R2 (TGTGGTGT-Cy3B), R3 (GAGAGAG-Cy3B) et R4 (TGTGTGT-Cy3B). La conception de l'origami 2D RESI nécessitait l'extension du site R1 à l'extrémité 5 'de sorte que les brins d'amarrage R1 et R3 adjacents puissent être espacés d'une seule paire de bases. Ainsi, le brin d'amarrage 5' 5xR1 (TCCTCCTCCTCCTCCCTCCT) et l'imageur 5' R1 (Cy3B-AGGAGGA) ont été utilisés plutôt que les versions 3' pour les deux origamis d'ADN 2D.

Toutes les structures d'origami d'ADN 2D ont été conçues en caDNAno40. L'auto-assemblage de l'origami d'ADN a été réalisé dans un mélange réactionnel à un pot avec un volume total de 40 μl, composé d'un brin d'échafaudage de 10 nM (pour la séquence, voir les données supplémentaires 2), d'agrafes pliantes de 100 nM (données supplémentaires 1), 500 Agrafes biotinylées nM (données supplémentaires 1) et brins d'agrafes de 1 μM avec extensions de site d'amarrage (données supplémentaires 1) dans un tampon de pliage d'origami d'ADN 2D. Le mélange réactionnel a ensuite été soumis à une rampe de recuit thermique à l'aide d'un thermocycleur. Tout d'abord, il a été incubé à 80 ° C pendant 5 min, refroidi en utilisant un gradient de température de 60 à 4 ° C par paliers de 1 ° C par 3,21 min et finalement maintenu à 4 ° C.

La structure du disque d'origami d'ADN 3D a été conçue en caDNAno40. L'auto-assemblage du disque d'origami d'ADN a été réalisé dans un mélange réactionnel à un pot d'un volume total de 50 µl, composé d'un brin d'échafaudage p7560 de 20 nM (pour la séquence, voir les données supplémentaires 3), d'agrafes de pliage de noyau de 200 nM (Données supplémentaires 1) , séquences d'agrafes de 200 nM sans extension de poignée (données supplémentaires 1), agrafes biotinylées de 500 nM (données supplémentaires 1), brins d'agrafes de 2 μM avec extensions de site d'accueil R4 et brins d'agrafes de 4 μM avec extensions de site d'accueil R1 ou R3 (données supplémentaires 1) dans un tampon de pliage d'origami d'ADN 3D. Le mélange réactionnel a ensuite été soumis à une rampe de recuit thermique à l'aide d'un thermocycleur. Il a d'abord été incubé à 80 °C pendant 5 min puis refroidi à l'aide d'un gradient de température de 60 °C à 20 °C par paliers de 1 °C h–1 et finalement maintenu à 20 °C.

Après auto-assemblage, les structures ont été purifiées par électrophorèse sur gel d'agarose (1,5 % d'agarose, 1 × TA, 10 mM MgCl2, 0,5 × SybrSafe) à 4,5 V cm-1 pendant 1,5 h. Les bandes de gel ont été coupées, broyées et l'origami stocké dans des tubes Eppendorf à faible liaison à -20 ° C.

Pour la préparation des échantillons, une lame sans fond à six canaux (ibidi, n° 80608) a été fixée à une lamelle. Tout d'abord, 80 μl de BSA marqué à la biotine (1 mg ml-1, dissous dans du tampon A) ont été rincés dans la chambre et incubés pendant 5 min. La chambre a ensuite été lavée avec 360 μl de tampon A. Un volume de 100 μl de neutravidine (0,1 mg ml-1, dissous dans le tampon A) a ensuite été rincé dans la chambre et laissé se lier pendant 5 min. Après lavage avec 180 µl de tampon A puis avec 360 µl de tampon B, 80 µl de structures d'ADN marquées à la biotine (environ 200 pM) dans le tampon B ont été rincés dans la chambre et incubés pendant 5 min. Pour la mesure du disque d'origami d'ADN, des structures d'origami d'ADN 2D supplémentaires avec 12 sites cibles 9 espacés de 20 nm ont été incubées ensemble, l'origami du disque 3D servant de repères pour la correction de la dérive. Après l'incubation d'origami d'ADN, la chambre a été lavée avec 540 μl de tampon B. Pour les structures de disque d'origami d'ADN, 150 μl de nanoparticules d'or (dilué à 1:10 dans du tampon B) ont été rincés et incubés pendant 5 min avant de laver avec 540 μl de tampon B. Enfin, 180 μl de la solution d'imageur dans le tampon B ont été rincés dans la chambre. La chambre est restée remplie de solution d'imageur et l'imagerie a ensuite été réalisée. Entre les cycles d'imagerie, l'échantillon a été lavé trois fois avec 1 ml de tampon B jusqu'à ce qu'aucun signal résiduel de la solution d'imageur précédente ne soit détecté. Ensuite, la solution d'imageur suivante a été introduite. Pour RESI, deux tours d'imagerie ont été effectués avec les imageurs R1 et R4 présents au tour 1 et les imageurs R3 et R4 au tour 2 (R1 et R3 sondent les sites d'intérêt pour RESI et R4 sert à l'alignement).

Les nanocorps ont été conjugués comme décrit précédemment32. Les nanocorps non conjugués ont été décongelés sur de la glace, puis un excès molaire de 20 fois de lieur bifonctionnel DBCO-PEG4-maléimide a été ajouté et mis à réagir pendant 2 h sur de la glace. Le lieur n'ayant pas réagi a été éliminé par échange de tampon avec du PBS en utilisant des filtres centrifuges Amicon (10 000 MWCO). Les nanocorps modifiés par DBCO ont été mis à réagir avec un excès molaire 5 × d'ADN fonctionnalisé par azide (R1, R2, R3 et R4) pendant une nuit à 4 ° C. La protéine non conjuguée et l'ADN libre ont été éliminés par chromatographie d'échange d'anions à l'aide d'un système ÄKTA pur équipé d'une colonne Resource Q de 1 ml.

Des cellules CHO (CCL-61, ATCC) ont été cultivées dans du milieu F-12K de Gibco Ham (Kaighn) additionné de 10 % de FBS (n° 11573397, Gibco). Des cellules U2OS-CRISPR-Nup96-mEGFP (un don des laboratoires Ries et Ellenberg) ont été cultivées dans du milieu 5A de McCoy (Thermo Fisher Scientific, n° 16600082) additionné de 10 % de FBS. Les cellules ont été passées tous les 2 à 3 jours avec de la trypsine-EDTA.

Les cellules U2OS-CRISPR-Nup96-mEGFP ont été ensemencées sur des chambres à fond de verre ibidi à huit puits (n° 80807) à une densité de 30 000 cm-2. Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 2,4 % dans du PBS pendant 30 min à température ambiante. Après fixation, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS. Des nanoparticules d'or (200 μl) ont été incubées pendant 5 min et lavées trois fois avec du PBS. Le blocage et la perméabilisation ont été effectués avec du Triton X-100 à 0,25 % dans un tampon de blocage pendant 90 min. Après lavage avec du PBS, les cellules ont été incubées avec des nanocorps anti-GFP 100 nM dans un tampon de blocage pendant 60 min à température ambiante. Pour activer RESI, la solution de nanocorps consistait en 25 nM de nanocorps anti-GFP couplés à un brin d'amarrage R1, R2, R3 et R4 avec une concentration totale de nanocorps de 100 nM. Les nanocorps non liés ont été éliminés en lavant trois fois avec du PBS, puis en lavant une fois avec du tampon C pendant 10 min. La postfixation a été réalisée avec du paraformaldéhyde à 2,4 % dans du PBS pendant 15 min. Après lavage 3x avec du PBS, la solution d'imageur dans le tampon C a été rincée dans la chambre. Entre les cycles d'imagerie, l'échantillon a été lavé avec 1 à 2 ml de PBS jusqu'à ce qu'aucun signal résiduel de la solution d'imageur précédente ne soit détecté. Ensuite, la solution d'imageur suivante a été introduite. Tout d'abord, les imageurs R1, R2, R3 et R4 ont été ajoutés simultanément à l'échantillon pour effectuer une mesure standard DNA-PAINT ; ensuite, l'imagerie RESI a été réalisée via quatre cycles d'imagerie ultérieurs avec un seul des imageurs.

mEGFP-Alfa-CD20 a été cloné par insertion d'Alfa-CD20 dans le plasmide mEGFP-C1 (n° 54759, Addgene). Un gblock Alfa-CD20 (obtenu auprès d'Integrated DNA Technologies) a été amplifié avec les amorces cggcatggacgagct et gtacaagtccgga et, après coupure avec les enzymes de restriction BsrGI et BamHI, un assemblage Gibson a été réalisé (mix 2 ×, NEB).

Les cellules CHO ont été ensemencées sur des chambres à fond de verre ibidi à huit puits (n° 80807) la veille de la transfection à une densité de 15 000 cm-2. La transfection avec mEGFP-CD20 a été réalisée avec Lipofectamine LTX comme spécifié par le fabricant. Les cellules CHO ont été autorisées à exprimer mEGFP-CD20 pendant 16 à 24 h. Ensuite, le milieu a été remplacé par du milieu F-12K frais + 10% FBS (dans le cas non traité) ou par du milieu F-12K + 10% FBS + 10 ug ml–1 RTX-Alexa 647 (un cadeau de Roche Glycart) ( dans le cas traité par RTX), suivie d'une incubation de 30 min. Après avoir lavé deux fois avec du milieu frais pendant 5 minutes, les cellules ont été fixées avec 250 µl de PFA à 4 % + 0,1 % de glutaraldéhyde préchauffé dans du PBS pendant 15 minutes. Les cellules CHO ont été lavées trois fois avec du PBS et trempées avec du Tris 100 mM pH 8,0 pendant 5 min. La perméabilisation a été effectuée pendant 5 min avec du Triton X-100 à 0,2 % dans du PBS, suivie de trois lavages avec du PBS. Les cellules ont été bloquées dans un tampon de blocage pendant 1 h à température ambiante (RT). Les nanocorps anti-GFP ont été incubés à une concentration totale de 25 nM pendant une nuit à 4 ° C; pour RESI avec quatre tours, cela a donné 6,25 nM chacun de GFP-Nb-R1/2/3/4. Après avoir lavé trois fois avec du PBS à température ambiante pendant 15 min, les cellules ont été postfixées avec 4% de PFA à température ambiante pendant 10 min, suivies d'un lavage et d'une postfixation comme décrit ci-dessus. Les nanoparticules d'or (90 nm) ont été diluées au 1/3 dans du PBS et incubées pendant 10 min à température ambiante et l'échantillon a été lavé deux fois avec du PBS pour éliminer l'or non lié. La solution d'imageur dans le tampon C pour le premier cycle a été incubée pendant 5 min, puis remplacée par un nouvel imageur, après quoi le premier cycle d'acquisition a commencé. Entre les cycles d'imagerie, l'échantillon a été lavé avec au moins 2 ml de PBS jusqu'à ce qu'aucun signal résiduel de la solution d'imageur précédente ne soit détecté. Ensuite, la solution d'imageur suivante a été introduite. L'imagerie RESI a été réalisée via quatre cycles d'imagerie ultérieurs avec un seul des imageurs. Lors du tour d'imagerie final, les imageurs R1, R2, R3 et R4 ont été ajoutés simultanément à l'échantillon pour effectuer une mesure standard DNA-PAINT.

L'imagerie de fluorescence a été réalisée à l'aide d'un microscope inversé (Nikon Instruments, Eclipse Ti2) avec le Perfect Focus System, en appliquant une configuration TIRF de type objectif équipée d'un objectif à immersion dans l'huile (Nikon Instruments, Apo SR TIRF ×100/ouverture numérique 1,49, huile). Un laser de 560 nm (MPB Communications, 1 W) a été utilisé pour l'excitation. Le faisceau laser a été passé à travers un filtre de nettoyage (Chroma Technology, n° ZET561/10) et couplé à l'objectif du microscope à l'aide d'un séparateur de faisceau (Chroma Technology, n° ZT561rdc). La fluorescence a été filtrée spectralement avec un filtre d'émission (Chroma Technology, nos ET600/50m et ET575lp) et imagée sur une caméra sCMOS (Andor, Zyla 4.2 Plus) sans autre grossissement, ce qui a donné une taille de pixel effective de 130 nm (après 2 × 2 binning). Le taux de lecture a été fixé à 200 MHz. Les images ont été acquises en choisissant une région d'intérêt de taille 512 × 512 pixels. L'imagerie 3D a été réalisée à l'aide d'une lentille cylindrique (Nikon Instruments, N-STORM) dans le chemin de détection. Les données brutes de microscopie ont été acquises à l'aide de μManager41 (v.2.0.1). L'éclairage par réflexion interne totale a été utilisé pour les données d'origami d'ADN 2D et 3D, ainsi que pour l'acquisition de CD20. Un éclairage à feuille optique hautement inclinée et laminée (HILO) a été utilisé pour l'acquisition des données NPC. Les conditions d'imagerie détaillées pour les expériences respectives sont présentées dans le tableau de données étendu 1.

En raison de l'hétérogénéité de la cible et de l'échantillon, la concentration optimale de l'imageur, c, utilisée pour obtenir un clignotement clairsemé varie. Ici, nous avons utilisé des concentrations de 100 pM (Nup96) à 800 pM (origami ADN). Les concentrations optimales de l'imageur ont été déterminées visuellement pour chaque échantillon. Les concentrations ont été modifiées jusqu'à ce que le clignotement soit fréquent mais suffisamment clairsemé pour obtenir une bonne résolution DNA-PAINT.

Le nombre moyen d'événements de liaison attendus par site de liaison lors d'une mesure DNA-PAINT est donné par la durée de la mesure tmeasurement et le temps d'obscurité moyen τdark (défini comme \({\tau }_{{\rm{dark}}} =\frac{1}{{k}_{{\rm{on}}}\times c}\), avec kon étant le taux d'activation d'un brin d'imageur donné) comme :

Le nombre moyen de localisations par événement de liaison est donné par le temps lumineux moyen τbright et le temps d'exposition de la caméra texposition comme

Par conséquent, le nombre moyen de localisations attendues par site de liaison au cours de la mesure est

Il s'ensuit que le temps d'acquisition total nécessaire pour collecter les localisations nloc est, en moyenne,

Le nombre nécessaire de localisations, nloc, est calculé en utilisant \({\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\frac{{\sigma }_{{\rm{DNA}} \mbox{-} { \rm{PAINT}}}}{\sqrt{{n}_{{\rm{loc}}}}}\), et donc \({n}_{{\rm{loc}}}={\ gauche(\frac{{\sigma }_{{\rm{DNA}} \mbox{-} {\rm{PAINT}}}}{{\sigma }_{{\rm{RESI}}}}\right )}^{2}\) avec la précision de localisation DNA-PAINT σDNA-PAINT.

Pour des concentrations d'imageur attendues entre 50 et 800 pM, des temps d'exposition entre 100 et 200 ms et des cinétiques rapportées précédemment32, les temps nécessaires pour collecter 16 localisations (précision RESI de 1 nm étant donné σDNA-PAINT = 4 nm) varient entre 42 s (R2, 800 pM, temps d'exposition de 100 ms) et 314 min (R5, 50 pM, temps d'exposition de 200 ms).

Les données brutes de fluorescence ont été soumises à une reconstruction en super-résolution à l'aide du progiciel Picasso9 (dernière version disponible sur https://github.com/jungmannlab/picasso). La correction de la dérive a été effectuée avec une corrélation croisée redondante et des particules d'or comme repères pour les expériences cellulaires, ou avec des sites d'ancrage ADN-PAINT uniques comme repères pour les expériences d'origami.

L'alignement des cycles d'imagerie ultérieurs a été effectué de manière itérative dans Picasso9, en commençant par une corrélation croisée redondante et suivi d'un alignement fiducial d'or pour les expériences cellulaires. Chaque origami d'ADN a été équipé de sites d'ancrage DNA-PAINT supplémentaires qui ont été imagés simultanément avec les sites d'intérêt dans tous les cycles d'imagerie, permettant ainsi leur utilisation comme repères. Tout d'abord, une corrélation croisée redondante (mesures d'origami 2D et 3D) et un alignement d'or (mesures 3D) ont été effectués dans Picasso Render. Pour corriger le mouvement nanoscopique de l'origami d'ADN individuel pendant l'échange de tampon, l'alignement des canaux n'a pas seulement été effectué sur le champ de vision complet, mais, en outre, de petites régions d'intérêt contenant un seul origami d'ADN ont été sélectionnées. Dans chaque région d'intérêt, l'alignement a ensuite été effectué via les sites d'amarrage fiducial de l'origami d'ADN. Cela a été effectué en dehors de Picasso dans un script Python personnalisé, non seulement pour trouver la traduction optimale entre les canaux, mais aussi pour corriger les rotations possibles de l'origami ADN.

Après l'alignement des canaux, les données DNA-PAINT ont été analysées à l'aide d'un algorithme de regroupement personnalisé pour chaque cycle d'imagerie. Cet algorithme est basé sur le fait que, dans DNA-PAINT, les localisations sont des mesures indépendantes de la position d'une molécule cible et sont observées comme étant distribuées gaussiennes. Pour attribuer des localisations à une molécule cible spécifique, nous avons d'abord utilisé une méthode d'ascension de gradient pour trouver le centre d'un nuage de localisation pour chaque cible. Nous avons ensuite attribué toutes les localisations distribuées circulairement autour du point central à la même molécule cible. Il s'agit d'une approximation valide car, en raison de la réduction de la densité cible effective par l'approche d'imagerie séquentielle de RESI, la majorité des nuages ​​de localisation provenant de cibles uniques sont suffisamment espacés.

L'algorithme de clustering utilise deux paramètres d'entrée : le rayon r, qui définit la taille finale des clusters et définit un environnement circulaire autour de chaque localisation, et le nombre minimal de localisations, nmin, représentant un seuil inférieur pour le nombre de localisations DNA-PAINT dans n'importe quel groupe.

Tout d'abord, le nombre de localisations voisines à une distance r de chaque localisation est calculé. Si une localisation donnée a plus de voisins dans son rayon r que toutes les localisations voisines, elle est considérée comme un maximum local. S'il y a plus de nmin localisations dans un cercle de rayon r autour d'un tel maximum local, ces localisations sont affectées au même cluster ; les autres ne sont pas considérés comme faisant partie d'un cluster et sont omis d'une analyse plus approfondie.

Un filtrage supplémentaire des grappes est effectué pour exclure les grappes qui proviennent d'un collage non spécifique d'imageurs à l'échantillon. Tout d'abord, la trame moyenne (valeur moyenne des numéros de trame dans lesquels les localisations se sont produites) de toutes les localisations attribuées au même cluster est calculée. Dans le cas d'un clignotement répétitif, la trame moyenne devrait représenter environ la moitié du nombre total de trames42. L'algorithme exclut donc tous les clusters avec une trame moyenne dans les premiers ou derniers 20 % des trames. Deuxièmement, les événements collants au milieu du temps d'acquisition peuvent être identifiés en divisant le temps d'acquisition en 20 fenêtres temporelles contenant chacune 5% de trames. Si l'une de ces fenêtres temporelles contient plus de 80 % des localisations dans le cluster, elle est exclue en tant qu'événement persistant.

Le choix du rayon de regroupement r et du seuil nmin dépend des conditions expérimentales respectives. Une valeur appropriée pour nmin peut être estimée en sélectionnant des nuages ​​de localisation provenant de molécules cibles uniques (c'est-à-dire bien séparées) dans Picasso Render, en exportant les propriétés de sélection et en traçant un histogramme du nombre de localisations dans chaque sélection. nmin est choisi pour différencier les populations correspondant à des cibles uniques et à des localisations de fond.

Le rayon r évolue avec la taille des nuages ​​de localisation et donc la précision de localisation. Si une valeur trop élevée est choisie, les clusters adjacents risquent de ne pas être séparés ; si r est trop petit, un "sous-clustering" dans une localisation peut se produire. Ce dernier se traduit également par un pic de NND à deux fois le rayon de regroupement. Une bonne valeur de départ a priori pour r est représentée par environ le double de la précision de localisation de la mesure ADN-PAINT sous-jacente. Picasso Render propose un outil (Test Clusterer) dans lequel l'effet de différents paramètres de clustering peut être testé pour une petite région d'intérêt.

Pour le clustering 3D, un rayon supplémentaire pour la direction z est introduit car la propagation des localisations en z est environ deux fois plus grande par rapport à x et y.

Suite à l'analyse des grappes, les centres des groupes de localisation DNA-PAINT ont été calculés sous forme de moyennes pondérées (wtd) en utilisant les précisions de localisation inverse au carré \((\frac{1}{{{\text{lp}}}^{2} })\) comme poids. Pour les coordonnées x et y :

Pour les coordonnées z, une moyenne standard sans poids est utilisée pour calculer les positions z. La précision de la localisation RESI résultante est la sem pondérée des localisations groupées sous-jacentes :

Le choix de \(1/{{\text{lp}}}^{2}\) comme poids est basé sur l'argument suivant : sous l'hypothèse que les localisations sont indépendantes et normalement distribuées avec la même moyenne, la moyenne pondérée basée sur les variances inverses comme poids est l'estimateur du maximum de vraisemblance de la moyenne de l'ensemble des localisations. Par conséquent, la variance de la moyenne pondérée est minimale (l'estimateur est optimal) lorsque les variances inverses des mesures individuelles \(1/{{\text{lp}}}^{2}\) sont choisies comme poids.

Enfin, nous prenons la moyenne des sem x et y résultants comme précision finale de chaque localisation RESI. Pour les coordonnées z, la précision est estimée à deux fois la précision xy. L'enregistrement des localisations RESI dans un fichier Picasso hdf5 nous a permis de les rendre sous forme de gaussiennes avec sd correspondant à leur précision respective.

Pour évaluer les performances de RESI, des simulations numériques in silico ont été réalisées. L'algorithme comprend les étapes suivantes.

Une grille de positions définies des sites de liaison (vérité terrain) est générée. En règle générale, une grille de positions a été générée (Extended Data Fig. 1a, en haut à gauche).

Les localisations SMLM (DNA-PAINT) sont simulées sous forme d'échantillons à partir d'une distribution gaussienne 2D avec σ = σSMLM. Un grand nombre (M) de localisations est généré par site de liaison (Extended Data Fig. 1a, en haut à droite).

Pour chaque site de liaison, des sous-ensembles de K localisations sont sélectionnés au hasard (K << M). Il en résulte \(n=\frac{M}{K}\) sous-ensembles de localisations SMLM (Extended Data Fig. 1a, en bas à gauche) qui sont ensuite moyennés pour générer n localisations RESI (Extended Data Fig. 1a, en bas à droite) .

Les localisations RESI résultantes sont ensuite présentées dans un histogramme (Extended Data Fig. 1b) et la trace (tr) de la matrice de covariance est calculée. La précision RESI est estimée à \({\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\sqrt{\frac{1}{2}tr({\rm{cov}}\left(x,y\right ))}\) (Données étendues Fig. 1c). Cette définition a déjà été utilisée sur le terrain comme métrique scalaire pour la variance 2D8.

Les étapes 3 et 4 sont répétées pour différentes valeurs de K pour étudier numériquement σ = σRESI(K).

Pour évaluer la précision du RESI dans les données expérimentales, une méthode analogue a été utilisée. En bref, le total M de localisations ADN-PAINT de chaque groupe correspondant à un seul site de liaison a été rééchantillonné au hasard en sous-ensembles de localisations K, puis les étapes 4 et 5 ci-dessus ont été effectuées pour évaluer σRESI. Le σRESI tracé sur la figure 3d est la valeur moyenne de tous les sites de liaison uniques dans l'ensemble de données. Les barres d'erreur représentent le sd des différentes valeurs σRESI calculées pour différents sites de liaison.

Notez que cette analyse ne peut être effectuée que pour K << M afin d'avoir suffisamment de \(n=\frac{M}{K}\) localisations RESI pour une estimation statistiquement significative. Étant donné que la localisation RESI finale prend en compte toutes les localisations M DNA-PAINT, la précision finale est extrapolée comme \({\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM }}}}{\sqrt{M}}\).

Dans RESI, la rareté des sites de liaison dans l'échantillon est obtenue en marquant une seule espèce de biomolécules avec différentes séquences d'ADN orthogonales. Le processus de marquage est effectué de manière stochastique : n marqueurs différents (par exemple, des nanocorps conjugués à l'ADN) ciblant la même espèce protéique sont incubés simultanément dans l'échantillon et donc la probabilité que chaque protéine soit marquée avec une certaine séquence i (i = 1, …, n) est \({p}_{i}=\frac{1}{n}\), étant donné que la même concentration de chaque marqueur est utilisée. Par la suite, n cycles d'imagerie sont effectués pour enregistrer tous les groupes de localisations nécessaires pour obtenir l'image RESI finale.

Le nombre minimum d'étiquettes (n) et de cycles nécessaires pour obtenir une rareté suffisante des sites de liaison dans chaque cycle d'imagerie dépendra principalement de trois facteurs : la précision et la densité de la localisation SMLM et l'arrangement moléculaire de la protéine d'intérêt. Nous décrivons ici comment ces paramètres affectent les résultats finaux RESI à l'aide de quelques exemples pratiques.

Un cas d'étude typique est celui de protéines simples disposées en dimères, qui à leur tour présentent une autre organisation spatiale spécifique dans l'espace. C'est le cas, par exemple, du Nup96 dans le NPC. Dans ce cas, le marquage stochastique doit être tel que la probabilité de marquer deux protéines formant un dimère avec des séquences différentes soit suffisamment élevée. Pour n cycles d'étiquetage/d'imagerie, la probabilité est

pour n = 4 cycles de marquage/imagerie P(séq. diff.) ≈ 75 %. Nous avons choisi n = 4 pour démontrer qu'il fournit un P (diff. séq.) relativement élevé avec seulement quelques tours d'imagerie. Nous notons, cependant, que n> 4 pourrait être utilisé pour augmenter P (diff. seq.) Et donc pour maximiser la rareté des sites de liaison marqués à chaque tour.

Pour résoudre un ensemble d'un nombre arbitraire de molécules, m, espacées plus étroitement que la résolution de DNA-PAINT, elles doivent être marquées avec n séquences orthogonales. En général, la proportion de m molécules marquées avec n séquences orthogonales, et donc la proportion d'ensembles résolubles de molécules, suit l'équation

C'est un cas courant, par exemple pour les récepteurs membranaires. Si les protéines sont distribuées de manière CSR (Extended Data Fig. 14a) à une densité donnée, DNA-PAINT peut déjà résoudre des protéines individuelles suffisamment espacées de leurs NN. Nous considérerons que les protéines à une distance d = 4 × σDNA-PAINT sont résolues de manière fiable (notez que ce critère est nettement plus strict que 2,35 × σDNA-PAINT). Ensuite, pour une densité donnée, l'histogramme NND peut être calculé et la fraction des distances inférieures à d calculée (Extended Data Fig. 14b). Cela représente la fraction de protéines uniques, F, qui ne seront pas résolues par DNA-PAINT. Ici, nous traçons F en fonction à la fois de la densité et de la résolution (Extended Data Fig. 14c). Une telle carte fournit déjà un outil pour comprendre le niveau de résolution SMLM nécessaire pour résoudre des protéines uniques à une densité donnée.

RESI peut être interprété ici comme un moyen de réduire la densité effective en divisant les cibles en différents sous-ensembles étiquetés de manière stochastique. Par conséquent, la densité effective de chaque tour sera réduite selon la formule \(\rho =\frac{{\rm{density}}}{n}\). Données étendues La figure 14d montre des coupes unidimensionnelles de la carte 2D pour fournir des lignes directrices pour choisir le nombre de séquences orthogonales (et donc de cycles d'imagerie) nécessaires pour pouvoir effectuer RESI efficacement. Par exemple, pour une résolution initiale de 20 nm (σ = 5 nm), ce qui est typique pour DNA-PAINT dans un contexte cellulaire, et une densité de \({\rm{d}}{\rm{e}}{ \rm{n}}{\rm{s}}{\rm{i}}{\rm{t}}{\rm{y}}=200\,\frac{{\rm{m}}{\ rm{o}}{\rm{l}}{\rm{e}}{\rm{c}}{\rm{u}}{\rm{l}}{\rm{e}}{\rm {s}}}{\mu {{\rm{m}}}^{2}}\) (relativement élevé), n = 4 séquences différentes suffisent pour fournir P(diff. seq.) ≈ 90% pour les protéines en dessous de d (Données étendues Fig. 14d). Ces protéines seront alors résolubles par RESI.

Une moyenne sans modèle des données Nup96 a été réalisée pour les mesures DNA-PAINT et RESI du même noyau, comme décrit par Wu et al.30. Les fichiers Picasso hdf5 respectifs ont été segmentés dans SMAP43 et enregistrés dans un format de fichier compatible pour la moyenne en utilisant les plugins segmentNPC, NPCsegmentCleanup et sitenumbers2loc. Une moyenne sans modèle a ensuite été effectuée sur les fichiers _sml.mat résultants avec des paramètres par défaut en exécutant le script particuleFusion.m dans Matlab (disponible avec le code source SMAP). Les moyennes indiquées correspondent au résultat de l'itération finale, dans laquelle chaque point est rendu avec une gaussienne de σ = 2 nm en x, y et z.

Pour interpréter les résultats des données NND dans les cellules non traitées, des simulations numériques ont été effectuées. Brièvement, deux populations, l'une de monomères CD20 et l'autre de dimères avec une distribution CSR, ont été simulées puis leurs NND calculés. L'algorithme peut être résumé comme suit :

Choix des paramètres. Densité de monomères : nombre de monomères par unité de surface ; densité de dimères : nombre de dimères par unité de surface ; distance dimère : distance attendue entre les deux molécules incluant la construction de marquage ; incertitude : variabilité de la position de chaque molécule due à des erreurs d'étiquetage et de localisation ; efficacité de l'étiquetage : fraction de molécules de référence qui seront réellement étiquetées et mesurées. La densité observée, qui doit correspondre au paramètre expérimental, devient alors densité observée = (densité de monomères + densité de dimères) × efficacité de marquage. Pour la quantification de l'efficacité de marquage du nanocorps GFP conjugué à l'ADN, nous avons utilisé une lignée cellulaire CHO transfectée de manière transitoire exprimant une étiquette GFP et Alfa à l'extrémité C-terminale d'une protéine membranaire monomère (par exemple, CD86). Nous avons ensuite marqué GFP- et Alfa-tag en utilisant leurs nanocorps apparentés conjugués à deux séquences d'amarrage orthogonales et effectué deux cycles d'échange-PAINT. Nous avons ensuite obtenu les paramètres les mieux adaptés pour un échantillon comprenant des paires de GFP/Alfa-tag et des Alfa-tags isolés, de la même manière que l'analyse du dimère/monomère CD20 est effectuée. Le rapport de ces deux populations est ensuite utilisé comme estimation de l'efficacité de l'étiquetage. Tous les détails de l'approche de quantification seront disponibles dans un manuscrit actuellement en préparation.

Simulation de monomères : un ensemble de coordonnées spatiales avec une distribution CSR et une densité donnée sont dessinées ; simulation de dimères : un ensemble de coordonnées spatiales avec distribution CSR sont dessinées, représentant le centre de chaque dimère. Pour chaque centre dimère, deux positions sont générées avec une orientation aléatoire et une distance avec une distance dimère de valeur attendue. La position de chaque couple de molécules est tracée en tenant compte du paramètre d'incertitude (tiré d'une distribution gaussienne).

Un sous-ensemble aléatoire de molécules «détectables» est extrait de l'ensemble de vérité au sol (fraction = efficacité de l'étiquetage) pour simuler le processus d'étiquetage.

Les NND sont calculés sur le sous-ensemble de molécules détectables.

Les paramètres densité de monomères = 212 μm–2, densité de dimères = 0 μm–2, incertitude = 5 nm et efficacité de marquage = 50 % ont été utilisés pour comparer les données des cellules traitées au RTX avec une distribution CSR des monomères.

Pour le cas non traité, les paramètres les mieux ajustés ont été obtenus par un algorithme itératif, non linéaire, des moindres carrés. La densité observée expérimentalement (50 molécules µm–2) est utilisée pour la simulation.

Pour chaque ensemble de paramètres, une simulation est effectuée, les NND sont histogrammes et la somme des différences au carré entre la simulation et l'histogramme expérimental est calculée. Un ajustement consiste à trouver les paramètres qui minimisent la somme des différences au carré.

D, distance dimère moyenne (nm)

σ_label, variabilité introduite par le marquage (nm)

frac_of_dimers, fraction de dimères (%)

Remarque : frac_of_monomers = 100 – frac_of_dimers

Ajustement grossier sur une large plage de paramètres pour déterminer la plage des paramètres les mieux adaptés. Plage D = 1–20 nm, σ_label = 1–20 nm, frac_of_dimers = 0–100 %.

Ajustement précis sur un espace paramétrique réduit autour des meilleurs résultats de l'étape précédente.

Les paramètres D_opt, σ_label_opt et frac_of_dimers_opt qui correspondent le mieux au modèle proposé et aux données sont maintenant trouvés. Dans ce cas, il en est résulté D_opt = 13, 5 nm, σ_label_opt = 5, 5 nm, frac_of_dimers_opt = 47% (Fig. 4e, f).

M est créé (dans ce cas, M = 100), simulé (à l'aide des jeux de données D_opt, σ_label_opt, frac_of_dimers_opt) avec le même nombre de molécules que les données expérimentales (environ 21 000).

M ensembles de données sont ajustés avec précision et les paramètres les mieux ajustés D_opt, σ_label_opt et frac_of_dimers_opt sont obtenus. Trois ensembles sont obtenus : D_opt, σ_label_opt et frac_of_dimers_opt.

Les distributions de D_opt, σ_label_opt et frac_of_dimers_opt sont étudiées. L'écart type peut être utilisé comme estimation des incertitudes des paramètres obtenues en b.

Les incertitudes des paramètres D_opt, σ_label_opt et frac_of_dimers_opt sont maintenant obtenues.

Les données de localisation de cette étude sont disponibles sur Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7795826). Les données brutes de microscopie obtenues au cours de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

RESI peut être effectué à l'aide de Picasso v.0.6.0, disponible sur https://github.com/jungmannlab/picasso avec la documentation fournie sur https://picassosr.readthedocs.io/en/latest/render.html. Les scripts personnalisés utilisés dans cette étude sont disponibles sur https://github.com/jungmannlab/resi.

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Nous remercions Y.-L. Wu et J. Ries pour leur aide précieuse avec la moyenne sans modèle. Nous remercions J. Schmied et F. Schueder pour leurs discussions utiles. Nous remercions MK Steen-Mueller et I. Glueck pour la relecture du manuscrit. Cette recherche a été financée en partie par le Conseil européen de la recherche via une subvention ERC Consolidator Grant (ReceptorPAINT, accord de subvention n° 101003275), la Fondation allemande pour la recherche via SFB1032 (projet A11, n° 201269156), la Fondation nationale danoise pour la recherche (Centre for Cellular Signal Patterns, DNRF135), le Human Frontier Science Program via une bourse pour jeunes chercheurs (n° HFSP RGY0065/2018), la Fondation Volkswagen via l'initiative « Life ?—A Fresh Scientific Approach to the Basic Principles of Life » (subvention n°. 98198), la Fondation Max Planck et la Société Max Planck. SS et TS reconnaissent le soutien de l'école doctorale QBM. SCMR, IB, PRS, ASE, EMU et MTS reconnaissent le soutien de l'école doctorale IMPRS-LS. L'IB reconnaît le soutien financier de Roche. LAM reconnaît une bourse postdoctorale du programme de recherche et d'innovation Horizon 20212022 de l'Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie no. 101065980.

Financement en libre accès fourni par la Max Planck Society.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Susanne CM Reinhardt, Luciano A. Masullo, Isabelle Baudrexel, Philipp R. Steen

Institut Max Planck de biochimie, Planegg, Allemagne

Susanne CM Reinhardt, Luciano A Masullo, Isabelle Baudrexel, Philipp R Steen, Rafal Kowalewski, Alexandra S Eklund, Sebastian Strauss, Eduard M Unterauer, Thomas Schlichthaerle, Maximilian T Strauss & Ralf Jungmann

Faculté de physique et Centre de nanosciences, Université Ludwig Maximilian, Munich, Allemagne

Susanne CM Reinhardt, Philipp R. Steen, Rafal Kowalewski, Sebastian Strauss, Eduard M. Unterauer, Thomas Schlichthaerle, Maximilian T. Strauss et Ralf Jungmann

Département de chimie et de biochimie, Université Ludwig Maximilian, Munich, Allemagne

Isabelle Baudrexel, Alexandra S. Eklund & Christian Klein

Roche Innovation Center Zurich, Roche Pharma Research and Early Development, Schlieren, Suisse

Christian Klein

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Le SCMR a conçu et réalisé des expériences d'origami ADN 2D et 3D ainsi que Nup96, développé le logiciel d'analyse et analysé les données d'origami ADN et Nup96. LAM a conçu et réalisé des simulations informatiques, contribué au logiciel d'analyse et analysé les données d'origami ADN, Nup96 et CD20. IB a conçu et mené des expériences CD20 et analysé les données CD20. PRS a conçu et mené des expériences d'origami ADN 2D, contribué au logiciel d'analyse et analysé les données d'origami ADN et Nup96. RK et TS ont contribué au logiciel d'analyse. SS a développé des sondes de marquage. ASE, SS, EMU et MTS ont réalisé des expériences RESI préliminaires. CK a contribué à la conception d'études ciblant CD20 et à leur interprétation. SCMR, LAM, IB, PRS et RJ ont interprété les données et rédigé le manuscrit. RJ a conçu le concept, conçu des expériences et supervisé l'étude. SCMR, LAM, IB et PRS ont contribué à parts égales. Tous les auteurs ont examiné et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Ralf Jungmann.

CK déclare l'emploi, les brevets (non liés à ce travail) et l'actionnariat avec Roche.

Nature remercie Alistair Curd et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, Une grille de positions définies des sites de liaison est générée (en haut à gauche), les localisations SMLM (DNA-PAINT) sont simulées sous forme d'échantillons d'une distribution gaussienne (en haut à droite). Les localisations pour un seul site de liaison ont été tracées pour plus de clarté. Pour chaque site de liaison, des sous-ensembles de localisations K sont sélectionnés au hasard (en bas à gauche) et moyennés (en bas à droite). Un sous-ensemble exemplaire et sa moyenne sont mis en évidence. b, les localisations RESI résultantes sont histogrammes pour produire des images à différentes résolutions (valeurs K). c, Précision de localisation RESI σRESI vs K. Dépendance analytique sur \(\sqrt{K}\) (ligne bleue) et résultats numériques (points noirs). Un total de 1200 localisations SMLM par site sont simulées. Les barres d'erreur représentent la moyenne ± 1 sd

a, conception d'origami d'ADN comportant six paires de brins d'amarrage orthogonaux espacés de 5 nm (R1 rouge, R3 bleu) et six brins d'amarrage d'alignement (R4 vert). Voir Méthodes pour les détails de la séquence. b, les paramètres d'acquisition DNA-PAINT ont été réglés de telle sorte que 5 nm n'étaient pas résolubles de manière cohérente. c, Premier cycle d'imagerie réalisé avec les imageurs R1 (cible) et R4 (alignement, sites encerclés). d, deuxième cycle d'imagerie réalisé avec R3 (cible) et des imageurs d'alignement (R4, sites encerclés). Les sites d'alignement ont été utilisés pour l'alignement en translation et en rotation entre les tours. e, RESI résout les distances de 5 nm. f, La distance et l'orientation entre les brins d'amarrage R1 et R3 sont conformes à la conception. g, Une moyenne de 90 structures d'origami d'ADN révèle des résultats cohérents et d'excellentes performances d'alignement. Les chiffres indiquent la distance entre les tours.

Origami d'ADN représentatif de l'autre côté du champ de vision de la mesure. a, origami à quatre ADN, illustré à la résolution DNA-PAINT (rangée supérieure) et à la résolution RESI (rangée inférieure). L'insert représente une paire de brins d'amarrage espacés d'env. 5 nm. b, 40 origamis ADN supplémentaires, présentés à la résolution DNA-PAINT (rangées supérieures) et à la résolution RESI (rangées inférieures).

a, conception d'origami d'ADN comportant une paire de brins d'amarrage orthogonaux (R1 rouge, R3 bleu) ainsi que six brins d'amarrage d'alignement (R4 vert). Les brins d'amarrage s'étendent à la fois de la surface supérieure et inférieure de l'origami d'ADN (insert). b, La conception garantit que tous sauf la paire de brins d'amarrage R1/R3 sont suffisamment espacés pour être résolus par DNA-PAINT. c, l'imagerie 3D DNA-PAINT résout les sites d'alignement R4, résout à peine R1/R3 axialement et ne résout pas R1/R3 latéralement. d, Imagerie séquentielle 3D DNA-PAINT avec les sites R4 utilisés pour l'alignement. e, RESI résout R1/R3 à la fois axialement et latéralement. f, Une superposition de 88 origamis d'ADN révèle un bon alignement global malgré l'hétérogénéité structurelle. g, Moyenne de 88 origamis ADN. h, La moyenne des particules récupère la structure avec une incertitude d'alignement de 0,7 nm CI = [0, 1,6] nm, montrant une distance entre les positions moyennes R1/R3 de 11,6 ± 0,8 nm (distance xy : 2,5 ± 0,4 nm, z -distance : 11,3 ± 0,8 nm), correspondant aux distances prévues20. La même échelle s'applique à tous les panneaux de grossissement. L'IC décrit un intervalle de confiance à 68 %.

Origami d'ADN 3D représentatif de l'autre côté du champ de vision de la mesure. a, origami à cinq ADN, illustré à la résolution DNA-PAINT (rangée supérieure) et à la résolution RESI (rangée inférieure). L'échelle de couleurs à droite représente la position z des localisations. Les coordonnées z mesurées pour chaque origami ADN ont été décalées d'une constante de sorte que la localisation la plus basse pour une structure donnée soit définie comme étant à z = 0. Cela garantit une utilisation complète de la gamme de couleurs. b, 32 origamis ADN supplémentaires, montrés à la résolution DNA-PAINT (rangées supérieures) et à la résolution RESI (rangées inférieures). Les positions z sont colorées selon l'échelle de couleurs dans le panneau a.

PNJ représentatifs de tout le champ de vision de la mesure. a, Six PNJ, mesurés à l'aide de DNA-PAINT (rangée supérieure) et RESI (rangée inférieure). L'échelle de couleurs à droite représente la position z des localisations. Les coordonnées z mesurées pour chaque PNJ ont été décalées d'une constante de sorte que la localisation la plus basse pour une structure donnée soit définie comme étant à z = 0. Cela garantit une utilisation complète de la gamme de couleurs. b, 72 PNJ supplémentaires, mesurés à l'aide de DNA-PAINT (rangées supérieures) et RESI (rangées inférieures). Les positions z sont colorées selon l'échelle de couleurs dans le panneau a.

a, Moyenne sans modèle pour les mesures DNA-PAINT de Nup96 (N = 1045 PNJ). Une vue isométrique inclinée est affichée. b–d, DNA-PAINT résout les anneaux nucléoplasmiques et cytoplasmiques et récapitule leur symétrie octuple, mais ne parvient pas à résoudre les protéines Nup96 individuelles. e, Les vues latérales de toutes les paires Nup96 dans les deux anneaux révèlent l'orientation angulaire mais ne résolvent pas les protéines Nup96 individuelles. f, moyenne sans modèle pour les mesures RESI de Nup96 (N = 1190 PNJ). g – i, RESI récapitule les anneaux nucléoplasmiques et cytoplasmiques ainsi que leur symétrie octuple et résout les protéines Nup96 adjacentes individuelles dans la majorité des cas. j, Les vues latérales des huit paires Nup96 dans les deux anneaux révèlent l'orientation angulaire ainsi que, dans certains cas, les protéines Nup96 individuelles adjacentes. k, La structure Cryo-EM du complexe de pores nucléaires indique qu'une protéine Nup96 donnée aura des voisins espacés de 11 nm, 39 nm, 71 nm, 93 nm et 101 nm. l, L'exécution du regroupement et de l'analyse du voisin le plus proche pour les données DNA-PAINT révèle un pic à env. 40 nm, correspondant à la distance entre deux paires Nup96, mais pas en dessous. RESI, d'autre part, présente un premier pic à env. 15 nm, correspondant à la distance entre Nup96 adjacentes tout en tenant compte de l'erreur de liaison (taille de l'étiquette). m, l'analyse des distances du premier au dixième voisin le plus proche pour RESI et DNA-PAINT récapitule les distances à partir de (k), mais seul RESI résout la plus petite distance. Toutes les barres d'échelle : 20 nm.

Origami d'ADN représentatif de l'autre côté du champ de vision de la mesure. a, origami à quatre ADN, illustré à la résolution DNA-PAINT (rangée supérieure) et à la résolution RESI (rangée inférieure). Les inserts montrent des paires de brins d'amarrage directement adjacents résolus par RESI. b, 42 origamis ADN supplémentaires, montrés à la résolution DNA-PAINT (rangées supérieures) et à la résolution RESI (rangées inférieures).

a, origami d'ADN comportant six brins d'alignement (vert R4) et six paires de brins d'amarrage orthogonaux (rouge R1, bleu R3) espacés d'une paire de bases. b, la représentation RESI avec les localisations RESI du tour 1 en rouge et du tour 2 en bleu illustre un excellent alignement. Les distances entre les localisations RESI des rondes 1 et 2 sont définies comme illustré. c, La superposition de 42 origamis d'ADN et la réalisation d'une moyenne de particules récupèrent la structure avec une incertitude d'alignement de 1,2 Å CI = [0, 4,6] Å, montrant les distances entre les positions moyennes des sites à 9,5 ± 2,6 Å (moyenne sur six distances dans la moyenne ± moyenne sur les incertitudes propagées par erreur des six distances). La même échelle s'applique à tous les panneaux de grossissement. L'IC décrit un intervalle de confiance à 68 %.

a, l'imagerie ADN-PAINT de cellules CHO entières exprimant mEGFP-CD20, marquées avec des nanocorps anti-GFP, montre des molécules distribuées de manière homogène pour trois expériences indépendantes. b, les régions de zoom avant de DNA-PAINT montrent des cas dans lesquels les dimères n'ont pas pu être résolus. c, RESI révèle des paires de récepteurs espacées de moins de 10 nm, qui ne peuvent pas être résolues dans les cas DNA-PAINT. d, analyse de cellules entières des distances du premier voisin le plus proche (1ers NND) des récepteurs CD20 (les histogrammes des distances sont affichés). Seul RESI, mais pas DNA-PAINT, permet la détection de routine de distances inférieures à 10 nm entre les protéines. e, la précision de localisation RESI inférieure à 1 nm permet une détection de routine de distances inférieures à 10 nm, ce qui permet une évaluation précise du premier NND.

a, image d'ensemble DNA-PAINT de mEGFP-CD20 exprimant des cellules CHO traitées avec RTX. b, le marquage avec des nanocorps anti-GFP conjugués à l'ADN et l'imagerie avec DNA-PAINT révèlent une organisation d'ordre supérieur après le traitement RTX. RESI (encarts i-iii) atteint une résolution moléculaire et résout ainsi l'arrangement moléculaire de mEGFP-CD20. c, l'imagerie DNA-PAINT montre des molécules CD20 groupées. L'exécution de RESI avec les séquences R1, R2, R3 et R4 en quatre cycles d'imagerie distincts (code couleur) permet le regroupement des localisations provenant d'une seule cible. À partir des localisations groupées, les localisations RESI ont été calculées, permettant une véritable résolution d'une seule protéine.

a, l'imagerie ADN-PAINT de cellules CHO entières exprimant mEGFP-CD20, marquées avec des nanocorps anti-GFP, montre des molécules CD20 regroupées dans des cellules traitées au rituximab pour trois expériences indépendantes. b, les régions de zoom avant de DNA-PAINT montrent mEGFP-CD20 regroupées en arrangements en forme de chaîne. c, RESI révèle des paires de récepteurs espacées de moins de 10 nm dans les clusters, insolubles par DNA-PAINT. d, analyse de cellules entières des distances du premier voisin le plus proche (1ers NND) des récepteurs CD20 liés au Rituximab (les histogrammes des distances sont affichés). Seul RESI, mais pas DNA-PAINT, permet la détection de routine de distances inférieures à 10 nm entre les protéines. e, La détection de routine des distances inférieures à 10 nm par RESI récapitule le premier NND mesuré dans le cas non traité. Notamment, les pics NND mesurés dans les trois répétitions sont cohérents, indépendamment de la densité protéique.

a, Exemple d'hexamères CD20 simulés par la vérité au sol (cercles bleu clair, simulés sous forme de triangles de dimères avec des distances intra-dimères de 13,5 nm telles que mesurées expérimentalement) avec une distribution et une orientation aléatoires sur une surface 2D à la densité déterminée expérimentalement. b, l'incertitude de l'étiquette et l'efficacité de l'étiquetage (les cercles noirs indiquent les molécules marquées) sont prises en compte dans la simulation pour une comparaison réaliste. c, Protéines simulées dans des arrangements hexamères représentés sous forme de gaussiennes. d, Hexamers après analyse de cluster DBSCAN (les couleurs indiquent les clusters). e, image RESI des données CD20 après traitement RTX. f, localisations RESI des données CD20 après analyse de cluster DBSCAN (les couleurs indiquent les clusters). g, nombre de molécules par cluster détecté pour les données expérimentales et les hexamères simulés. h, Métrique de circularité des données expérimentales et des hexamères simulés après analyse de coque convexe des clusters. Nous notons que la forte baisse à 0,605 provient de la métrique de circularité maximale pour les clusters où la coque convexe est définie par trois molécules. Notamment, l'absence d'un pic de circularité à ~ 0, 7 dans les données expérimentales suggère que les molécules de CD20 ne sont pas disposées dans des structures hexamères isolées en forme d'anneau.

a, Exemple de simulation de protéines avec une distribution aléatoire spatiale complète (CSR) d'une densité donnée. b, Histogramme des distances des voisins les plus proches (NND). La ligne rouge indique la plus petite distance (d) qui peut être résolue par DNA-PAINT pour un ensemble donné de paramètres d'imagerie. La fraction de molécules avec un NN inférieur à ce seuil de distance (bleu, ombré) peut être calculée pour une densité donnée et une résolution DNA-PAINT donnée. c, carte 2D de la fraction de molécules non résolubles en fonction de la densité et de la résolution. d, les coupes 1D de c à différentes résolutions (code couleur) peuvent être utilisées comme guide de l'utilisateur pour estimer le nombre de cycles de multiplexage nécessaires pour effectuer RESI efficacement compte tenu d'une certaine fraction cible de distances non résolubles.

Séquences de brins d'agrafes pour l'origami d'ADN 2D avec des sites de liaison espacés de moins d'un nanomètre, 5 nm et 20 nm et séquences de brins d'agrafes pour l'origami 3D.

Séquence de brin d'échafaudage (M13mp18) pour l'origami d'ADN 2D.

Séquence de brin d'échafaudage (p7560) pour l'origami d'ADN 3D.

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Réimpressions et autorisations

Reinhardt, SCM, Masullo, LA, Baudrexel, I. et al. Microscopie à fluorescence à résolution Ångström. Nature 617, 711–716 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05925-9

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Reçu : 21 juillet 2022

Accepté : 07 mars 2023

Publié: 24 mai 2023

Date d'émission : 25 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-023-05925-9

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